German Title: Neue Ansätze zur Transgenese im Medakafisch (Orzyias latipes)

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Abstract

The aim of thesis was to improve the generation of transgenic medaka fish. General transgenesis including transient expression of reporter genes and germ line integration of reporter genes was improved by application of two novel techniques. In addition, one of these methods allows for the first time efficient enhancer trapping in fish. First, a transposon-based approach using the artificially reconstructed Sleeping Beauty (SB) transposon was established. To address the potential of SB for transgenesis, microinjection experiments were performed. Transgenes (GFP) and promoter fragments were flanked with the SB recognition sequences (inverted direct repeats (IR/DR)) and injected into one-cell stage medaka embryos with or without SB10 mRNA. Upon injection of a control construct, that lacks SB recognition sequences and without transposase, only 13 % of surviving embryos expressed GFP uniformly in the entire body. Conversely, when SB IR/DRs were included, uniform, promoter-dependent expression was the predominant effect (45 %). The presence of IR/DRs alone strongly enhanced promoter-dependent transgene expression in G0, indicating that SB IR/DRs significantly enhance transient transgene expression. G0 expression was a reliable indicator for the efficient selection of transgenic founders. Embryos that exhibit a uniform GFP expression in G0 result in the highest yield of transgenic fish. This facilitates an easy selection of putative founder fish for medium- to large-scale approaches. The SB system enhanced total transgenesis frequencies to 32 % compared to 4 % resulting from control construct injections. Strikingly, 12 % (21/174) of the transgenics featured typical characteristics of enhancer trap lines, i.e. spatially and/or temporally restricted transgene expression due to regulation imposed by sequences adjacent to the insertion site. Thus, a set of transgenic lines expressing GFP in developmentally important structures/organs can be established and used without devoting a major effort on the isolation and characterization of promoter elements. Second, a meganuclease approach was applied. Transgenes of interest were flanked by two I-SceI meganuclease recognition sites, and co-injected together with the I-SceI meganuclease enzyme into medaka embryos at the one-cell stage. Upon injection, the promoter-dependent expression was strongly enhanced. Already in G0, 78 % of injected embryos exhibited uniform promoter dependent expression compared to 26 % when injections were performed without meganuclease. The transgenesis frequency was raised to 30.5 % compared to 5-18 % for naked DNA. Even more striking was the increase in germ line transmission rate. In standard protocols it does not exceed a few percent, the number of transgenic F1 offspring of an identified founder fish generated with I-SceI reached the optimum of 50 % in most lines, indicating genome insertion events already at the one-cell stage. Meganuclease co-injection thus provides a simple and highly efficient tool to improve transgenesis by microinjection.

Translation of abstract (German)

Die Zielsetzung der Dissertation beinhaltete die Weiterentwicklung von Transgenese Methoden im Medakafisch. Über die Anwendung von zwei unterschiedlichen Ansätzen wurde dies sowohl für vorübergehende Expression von extra-chromosomalen Transgenen, als auch für die Etablierung von stabilen transgenen Fischen erreicht. Erstmals in Fischen, ermöglicht darüberhinaus eine der beiden Methoden die effiziente Durchführung von Enhancer-Trap Experimenten. Als erster Ansatz wurde eine auf dem synthetischen Transposon System Sleeping Beauty (SB) basierende Methode angewandt. Um das Transgenese-Potential dieser Methode zu untersuchen, wurden Mikroinjektionsexperimente durchgeführt. Transgen (GFP) und Promoter wurden beidseitig von SB Erkennungssequenzen flankiert (inverted repeats (IR/DR)) und zusammen mit mRNA der SB Transposase in Medaka Embryonen injiziert. Zur Kontrolle wurden Injektionen auch ohne Transposase oder ohne IR/DR durchgeführt. Bei Kontrollinjektionen (ohne IR/DR) zeigten lediglich 13% der überlebenden Embryonen eine gleichmässige Expression von GFP im gesamten Embryo, während IR/DR Sequenzen alleine oder bei Ko-injektionen mit Transposase diesen Anteil auf 45% erhöhten. GFP Expression in injizierten Fischen erwies sich als ausgezeichneter Indikator um stabile transgene Fische zu selektieren. Die Anwendung des SB Systems erhöhte die Transgeneserate von 4% bei Kontrollinjektionen auf 32%. Zusätzlich zeigten 12% der transgenen Fische (21/174) eine für Enhancer-Traps charakteristische räumlich und/oder zeitlich auf verschiedene aber bestimmte Bereiche begrenzte Expression von GFP. Dies lässt darauf schliessen, dass die genomische Insertion des Transgens in der Nähe von Enhancer-Elementen stattfand. Auf diese Weise kann sehr leicht eine Anzahl von transgenen Fischen generiert werden, die GFP in entwicklungsbiologisch interessanten Strukturen/Organen exprimieren. Auf eine vorherige, aufwendige Identifizierung von genetischen Kontrollelementen kann deshalb weitestgehend verzichtet werden. Für den zweiten Ansatz wurde eine sogenannte Meganuklease verwendet. Transgene wurden in diesem Fall beidseitig mit Erkennungssequenzen der I-SceI Meganuklease flankiert und zusammen mit dem I-SceI Enzym ebenfalls in sehr frühe Medaka Embryonen injiziert. Damit, konnte in 78% der überlebenden Embryonen eine gleichmässige GFP Expression erzielt werden. Im Gegensatz dazu war dies bei Kontrollinjektionen nur bei 26% der Embryonen möglich. Weiters konnte die Transgenesrate von maximal 18% bei Kontrollen auf mehr als 30% erhöht werden. Bei Standard Transgenese Ansätzen wird das Transgen nur an einen kleinen Anteil der Nachkommen weitergegeben. Mit Hilfe der Meganuklease konnte dieser Anteil auf das Maximum für Einzelinsertionen von 50% erhöht werden. Dies ist nur möglich wenn die Insertion des Transgens in das Wirtsgenom bereits im Einzell-Stadium stattfindet. Der Meganuklease Ansatz bietet so eine sher einfache aber sehr effiziente Möglichkeit die Transgeneseraten Mikroinjektionen zu verbessern.