English Title: Investigation of the localisation and accessibility of the N-termini of the structural proteins VP1 and VP2 in the capsid of the adeno-associated virus type 2

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Abstract

Bei dem Adeno-assoziierten Virus Typ 2 (AAV-2) handelt es sich um ein Parvovirus, das aufgrund seiner für den Menschen apathogenen Eigenschaften als Vektor für die Gentherapie genutzt wird. Das AAV-2 Kapsid wird von den drei Strukturproteinen VP1, VP2 und VP3 gebildet. Diese weisen ein Molekulargewicht von 87 kDa, 72 kDa und 62 kDa auf und besitzen überlappende Aminosäuresequenzen, die sich nur am N-terminalen Ende unterscheiden. Im N-Terminus von VP1 befindet sich eine Phospholipase A-Domäne, die bei der Infektion von AAV eine Rolle spielt. VP1, VP2 und VP3 liegen im Kapsid, das aus 60 Untereinheiten besteht, mit einer Stöchiometrie von 1:1:8 vor und besetzen symmetrisch äquivalente Positionen. In dieser Arbeit wurde das AAV-2 Kapsid auf struktureller Ebene untersucht. Dazu wurden leere AAV-2 Kapside mittels rekombinanter Adenoviren produziert und mit Hilfe von elektronenkryomikroskopischen Untersuchungen und dreidimensionaler Bildrekonstruktion analysiert. Die resultierende Rekonstruktion mit einer Auflösung von 10,5 Å weist charakteristische Erhebungen an den 3-fachen Symmetrieachsen, leere Kanäle an den 5-fachen Symmetrieachsen und globuläre Strukturen an den 2- fachen Symmetrieachsen auf. Diese Globuli wurden als mögliche Positionen für die bisher, auch in der später erschienenen Röntgenstruktur von AAV-2, nicht lokalisierten N-terminalen Bereiche von VP1 und VP2 identifiziert. Zur Überprüfung der Hypothese, dass es sich bei den globulären Strukturen um die N-Termini handelt, wurden VP1- bzw. VP2-Deletionsmutanten hergestellt. Den mutanten Kapsiden fehlen die globulären Strukturen an den 2-fachen Symmetrieachsen. Dafür treten innen an den Kanälen der 5-fachen Symmetrieachsen zusätzliche Proteindichten auf. Die Zugänglichkeit der N-Termini von VP1 bzw. VP2 auf der Kapsidoberfläche wurde mit zwei monoklonalen Antikörpern analysiert, die ihre Epitope im N-terminalen Bereich von VP1 bzw. VP1 und VP2 haben. Während leere wt AAVKapside und Kapside ohne VP1 keine Reaktion zeigten, war eine deutliche Reaktion bei den Kapsiden ohne VP2 sichtbar. Also muss in VP2 deletierten Kapsiden der NTerminus von VP1 von außen zugänglich sein. Bei DNA-haltigen wt Kapsiden liegen, wie bei den leeren, globuläre Strukturen an den 2-fachen Symmetrieachsen vor. Jedoch zeigen sie eine leichte Reaktion mit den N-terminalen Antikörpern. Um herauszufinden, unter welchen Bedingungen die N-Termini von VP1 auf dem wt AAV-Kapsid zugänglich werden, wurden die Kapside bei unterschiedlichen Temperaturen und abnehmenden pH-Werten inkubiert. Die biochemischen Analysen zeigen, dass die N-Termini von DNA-haltigen, jedoch nicht von leeren wt AAV-Kapsiden nach Inkubation bei 65°C und bei pH 4,5 zugänglich werden. Außerdem ist der Abbau der enkapsidierten DNA nach Behandlung bei 65°C und bei pH 4,5 durch DNase I möglich. Ob dies durch eine Konformationsänderung oder eine partielle Dissoziation der Kapside zustande kommt, kann nicht eindeutig unterschieden werden. Strukturelle Untersuchungen der Kapside nach Inkubation bei 65°C deuten jedoch auf eine konformative Veränderung hin, die sich in der Reduktion der Globuli an den 2-fachen Symmetrieachsen bei den DNA-haltigen Kapsiden äußert. Diese Ergebnisse lassen die Annahme zu, dass unter gewissen Umständen eine Konformationsänderung des Kapsids eintritt, durch die die N-terminalen Bereiche von VP1 und VP2 auf der Kapsidoberfläche zugänglich werden. Dabei könnte die Phospholipase aktiv werden, wodurch ein erfolgreicher Infektionsprozess mit AAV-2 ermöglicht wird.

Translation of abstract (English)

Adeno-associated virus type 2 (AAV-2) is a human parvovirus which has attended much interest as a general gene transfer vector. The AAV-2 capsid is composed of three structural proteins VP1, VP2 and VP3 which have relative molecular masses of 87 kDa, 72 kDa and 62 kDa with a unique N-terminus of VP1 and a common Cterminal region. The VP1 N-terminus contains a phospholipase A domain which is required for virus infectivity and gene transduction activity of AAV vectors at a postentry step. VP1, VP2 and VP3 are incorporated in the capsid with a likely molar ratio of 1:1:8 and form icosahedral shells composed of 60 subunits in which they occupy symmetrically equivalent positions. In this work the structural features of the AAV-2 capsid have been investigated. For this reason empty AAV-2 capsids were produced by means of recombinant adenoviruses and analysed by electron-cryomicroscopy and 3D-image reconstruction. The three-dimensional map at 10.5 Å resolution showed sets of three elongated spikes surrounding the three-fold symmetry axes and narrow empty channels at the five-fold axes. Globular structures at the inner surface of the capsid at the two-fold symmetry axes were identified as possible positions for the N-terminal extensions of VP1 and VP2. Although the x-ray structure of AAV-2 has been determined recently. the localisation of these extensions is still not defined. To proof the hypothesis that the globular structures represent the N-terminal regions of the VP proteins, mutant empty capsids were generated where either VP1 or VP2 were deleted. electron-cryomicroscopy and 3D-image reconstruction of the mutant capsids revealed that there is no difference regarding the outer surfaces, but the globular structures at the two-fold symmetry axes at the inner surface are missing when VP1 or VP2 was deleted. Additionally in both reconstructions there is a supplementary density at the inner part of the channels at the five-fold symmetry axes. To proof if the rearrangement at the inner surface of the capsids correlates with the accessibility of the N-terminal stretches of VP1 and VP2 on the capsid surface two monoclonal antibodies recognizing specific N-terminal epitopes were used. There was no reaction visible with wt empty capsids and capsids missing VP1, but capsids where VP2 was deleted show a strong reaction with both N-terminus specific antibodies. Controls with an antibody detecting intact capsids showed the presence of equal amounts of capsids. This means that in contrast to wt empty capsids the Ntermini of VP1 in the capsids devoid of VP2 must be accessible from outside. Empty wt AAV capsids and DNA-containing wt capsids presented principally the same structural features, although DNA-containing capsids showed a weak reaction with the antibodies. In order to investigate the conditions under which the VP1 N-termini of wt capsids become accessible on the capsid surface, capsids were treated with increased temperature and low pH. Biochemical analyses showed that the N-termini of full particles, but not of empty particles, seem to become accessible to the N-terminal specific antibodies after incubation at 65°C and at pH 4,5. In addition to that the DNA of full particles became susceptible to DNase I digestion after virus incubation at 65°C or at pH 4,5. If this is due to a conformational change of the capsid or a partial dissociation is not clear. However, structural investigations of the capsids after treatment at 65°C suggest that there is a conformational change, visible by the reduction of the globules at the two-fold symmetry axes. These results indicate that under certain conditions during infection a conformational change of the capsid shell might occur that make the N-termini become exposed to the outer surface of the capsids to develop their phospholipase activity which is involved in an efficient infection process.