English Title: N-[2-(Diethylamino)ethyl]benzamides as melanoma affine carrier molecules for cytostatics and gadolinium chelates

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Abstract

Wegen ihrer hohen in vivo Melanomaffinität wurden N-[2-(Diethylamino)ethyl]benzamide als melanomselektive Trägermoleküle für Zytostatika ausgewählt. Es wurden Chlorambucilkon-jugate, Chlorambucilanaloga, Dacarbazinanaloga, Methotrexatkonjugate, ein Platinkomplex und ein Anthrazyklinkonjugat synthetisiert, analytisch charakterisiert und ihre IC50-Werte für murine B16 Melanomzellen, SkMel 28 (humane Melanomzellen), Mausfibroblasten, MH3924A (Morris Hepatom) und HeLa (humanes Zervixkarzinom) ermittelt. Alle Chlorambucilkonjugate und 3 von 5 Chlorambucilanaloga erwiesen sich für jede der getesteten Zellinien toxischer als Chlorambucil. Drei Chlorambucilkonjugate waren für die Melanomzellen toxischer als Dacar-bazin. Zwei Monotriazene und ein Bis-Triazen waren für die Melanomzellen potenter als Dacar-bazin und Chlorambucil. Diese Triazene verursachten auch bei den anderen Zellinien eine stärkere Proliferationshemmung. Alle anderen Benzamide mit Triazenstruktur zeigten keine zytostatische Aktivität. Das Anthrazyklinderivat wirkte besser als Dacarbazin und Chlorambucil. Der Platinkomplex war zytostatisch inaktiv. Obwohl Nicht-Melanomzellen keine Anreicherung der Benzamid-Zytostatika zeigten, waren die Benzamid-Zytostatika auch für diese Zellinien toxischer als Chlorambucil und Dacarbazin. Um die mechanistischen Gründe dieser Versuchsbeobachtungen aufzudecken, wurden die DNS- und Melaninaffinitäten von vier verschiedenen Benzamidzytostatika sowie von den Zytostatika Dacarbazin und Chlorambucil ermittelt. Zusätzlich wurde der Einfluß von extrazellulärem, synthetischen Melanin auf die Zytotoxizität der Verbindungen für B16 und MH3924A Zellen untersucht. Untersuchungen über die Auswirkungen der Zytostatika auf den intramelanosomalen pH-Wert, die Tyrosinaseaktivität und den Melaningehalt von B16 Melanomzellen schlossen diese Experimente ab. Es wurde gezeigt, dass das geteste Chlorambucilkonjugat und das Chlorambucilanalogon eine höhere DNS-Affinität aufweisen als Chlorambucil. Die Zytostatika mit einer Triazenfunktion im Molekül wurden zu einem größeren Ausmaß an die DNS gebunden als die anderen Zytostatika, wobei die Triazen-Benzamide stärker an DNS gebunden wurden als Dacarbazin. Die IC50-Werte für B16 Melanomzellen korrelieren mit der Melaninaffinität der Benzamid-Zytostatika. Je höher die Melaninaffinität ist, desto geringer ist die zytostatische Wirkung. Die Benzamidzytostatika heben den intramelanosomalen pH-Wert an, was zu einer Erhöhung der Tyrosinaseaktivität und damit auch des Melaningehaltes führt. Die Folge dieser Reaktionskette ist die Verstärkung des Abfangeffektes für Benzamid-Zytostatika. Außerdem wurde der Versuch unternommen, durch Konjugation von Gadoliniumchelatoren mit N-[2-(Diethylamino)ethyl]benzamiden, melanomspezifische MRT-Kontrastmittel zu erhalten. Die Konjugation von N-[2-(Diethylamino)ethyl]benzamiden an DOTA oder DTPA führte zu einer geringen Aufnahme von Gadolinium in die Zellen. Durch die Verwendung von Schleppermolekülen konnte eine Verbesserung der Aufnahme von Gadolinium in die Zellen erzielt werden, allerdings war die in MH3924A gefundene Gadoliniummenge größer als in den B16 Melanomzellen. Die Polyamine waren die effektivsten Schleppermoleküle.

Translation of abstract (English)

Due to their high in vivo affinity to malignant melanoma N-[2-(diethylamino)ethyl]benzamides were considered as melanoma selective carriers of alkylating drugs and methotrexate. Chlorambucil conjugates, chlorambucil analogues, dacarbazine analogues, methotrexate conjugates, a platinum complex and an anthracycline conjugate were synthesized, characterized and their IC50-values were determined for B16 melanoma, SkMel 28 human melanoma, NIH 3T3 fibroblasts, Morris-hepatoma (MH3924A) and human cervix carcinoma (HeLa) cells. All chlorambucil conjugates and 3 of 5 chlorambucil analogues were more toxic than chlorambucil for all tested cell lines. Three chlorambucil conjugates were toxic for melanoma cells than dacarbazine. Two monotriazenes and one bistriazene were more potent than chlorambucil and dacarbazine. But the other cell lines were sensitive as well. All other synthesized benzamide derivatives with a triazene function were not toxic. Conjugates of N-(2-(diethylamino)ethyl)benzamides with methotrexate were not superior over methotrexate. The anthracycline conjugate was more potent than the anticancer drugs chlorambucil and dacarbazine. The platinum complex had no cytostatic effect. Even though these agents were not accumulated by non-melanoma cells they were also found to be more toxic for them. In order to find mechanistic reasons for this effect, DNA- and melanin-binding affinities of four benzamide-drug conjugates together with the parent compounds were measured. Additionally, the influence of melanin on the cytotoxicity of B16 melanoma and Morris hepatoma cells (MH3924A) and the influence of these substances on the melanosomal pH, tyrosinase activity and melanin content in B16 melanoma cells was examined. It could be shown that all tested chlorambucil conjugates and analogues have a higher DNA affinity than chlorambucil. The compounds with a triazene functionality were bound stronger to the DNA than the other cytostatics. The triazene benzamides exhibited a higher DNA affinity than dacarbazine. The obtained IC50-values correlate with the melanin affinity of the benzamide derivatives. High melanin affinity resulted in a lower cytotoxic effect. These compounds raise the acidic pH of melanosomes thereby enhancing tyrosinase activity and elevating the melanin content. The consequence of this reaction chain is an enhancement of the scavenging effect for benzamide-drug conjugates. Furthermore it was evaluated whether conjugating N-[2-(diethylamino)ethyl]benzamides to gadolinium chelators results melanoma specific MRI contrast agents. DOTA- and DTPA- conjugates of N-[2-(diethylamino)ethyl]benzamides yielded only in low gadolinium uptake. By using carrier molecules the gadolinium uptake could be improved, whereby the polyamines resulted in the highest internalised gadolinium values. The hepatoma cells internalised the complexes to a greater extend than the B16 melanoma cells.