German Title: Entwicklung von Methoden zur Struktur- und Funktionsaufklärung in Lebenden und Fixierten Zellen auf Einzelmolekülniveau mittels Koinzidenzanalyse und Spektral-Aufgelöster Fluoreszenzlebensdauermikroskopie [SFLIM]

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Abstract

The proceeding evolution in molecular biology and biochemistry led to groundbreaking results in the recent years, like the mapping of the human genome. The consequence of the rising knowledge of biological structures and mechanism is that gradually smaller and infrequent units, which are not resolvable by common methods anymore, are subject to investigation. In principle there are two question in the structural exploration of biological systems: Where are the single components localized, or what distances do they have in respect to each other, and from which or how many units are they composed? To solve these questions single-molecule spectroscopy is an excellent tool. The localization of dye-labeled biomolecules is easy, as long as the distance between the single fluorophores exceeds the optical diffraction limit of about 200 nm. For distances between 1 and 10 nm the FRET-effect can be exploited. In the intermediate range of 10 to 200 nm, the so-called resolution gap, only few methods for distance determinations are available, which are usually technically demanding and limited to two dimensions. Since many biological relevant molecules, for example biomolecular machines, are exactly in this order of magnitude, it is of major importance to have a simple 3-dimensional method at hand, which closes the gap. For this purpose an algorithm based on confocal imaging microscopy has been developed, which facilitates the separation of colocalized dyes by their fluorescence lifetimes and spectral characteristics. The accuracy and applicability of the method was in this work using biological calibration compounds. Therefore DNA molecules of different lengths, whose double-stranded backbone is known to be very rigid, were terminally labeled with the dyes Bodipy 630 and Cy 5.5 and immobilized in a 3-dimensional matrix, a cell-like but homogenous inclusion reagent. Comparison with "worm-like chain" model calculations showed that the measured lengths were in good agreement with the model. Furthermore, measurements in cells were accomplished, which affirmed the suitability of the method in biological environment. Beside the localization of biomolecules more and more quantitative investigations of complex cellular units come to the fore. Often the matter is not exclusively anymore the determination of various subunits, which can be discriminated against each other by different dyes, but rather the detection of identical molecules, which assemble or are generated within a cell compartment. For example the read-out and transduction of the genetic information by polymerases, the transcription, takes place in so called transcription factories. A typical HeLa cell contains about 8.000 of such 40 to 80 nm sized centers each containing on average 8 polymerase II enzymes. The reason for the accumulation, as well as the exact number of polymerases, could not be determined so far due to a lack of suitable techniques. However, for the comprehension of the cell function it is of great importance to study these basic units. The first step in this direction, the counting of polymerase II molecules in transcription sites, ought to be conducted in the second part of this work. To be able to quantify colocalized molecules, the analysis of interphoton times deduced from antibunching experiments can be used. Therefore dyes are located in a microscopic image, subsequently singly positioned in the laser focus and the fluorescence is collected until photodestruction. Especially the carbopyronine derivatives Atto 620 and Atto 647 turned out to be best suitable for the experiments because of their high photostability and emission rate. To investigate the applicability of the method in cellular environment, dye labeled oligomers consisting of 40 thymines were incorporated into cells. It was shown that these units selectively and partly multiply hybridize to the up to 200 basepair long adenosine ends of mRNA. By coincidence it was possible to analyze up to four molecules in a single image spot. To reduce the density of the transcription centers for imaging and to enable molecule counting for the 3.000 transcription factories per nucleus, so called "cryosections", cell slices with a thickness of 100 nm, were introduced. The simplest method to label polymerase II molecules uses specific dye labeled antibodies, which singly bind to the polymerases. A fundamental requirement for the success of the experiment is a stoichiometric labeling of the antibodies with the dyes, i.e. no multiply- or unlabeled compounds are allowed to be present. Therefore a new method was developed, which allows preparing one to one labeled proteins and quantum dots by the introduction of an affine group at the dye. It could be shown that the antibodies selectively bind to their targets and first experiments with these probes towards the success of the experiment could be initiated.

Translation of abstract (German)

Die fortschreitende Entwicklung im Bereich der Molekularbiologie und Biochemie hat in den letzten Jahren zu bahnbrechenden Ergebnissen, wie der Entschlüsselung des menschlichen Genoms, geführt. Die Konsequenz der immer detaillierteren Kenntnis biologischer Strukturen und Mechanismen ist, dass immer kleinere und seltenere Einheiten, die mit herkömmlichen Methoden nicht mehr aufgeklärt werden können, Gegenstand der Forschung sind. Prinzipiell gibt es zwei Fragestellungen bei der Strukturaufklärung biologischer Systeme: Wo sind die Einzelkomponenten lokalisiert bzw. welche Abstände haben sie zueinander und aus welchen oder wie vielen Einheiten bestehen sie? Um diese Fragen zu beantworten, ist die Einzelmolekülspektroskopie ein hervorragendes Hilfsmittel. Die Lokalisation von farbstoffmarkierten Biomolekülen ist einfach, solange der Abstand der einzelnen Fluorophore die optische Auflösungsgrenze von ungefähr 200 nm übersteigt. Für Distanzen von 1 bis 10 nm kann der FRET-Effekt ausgenutzt werden. Im Zwischenbereich von 10 bis 200 nm, der sogenannten Auflösungslücke, gibt es nur wenige, zumeist technisch anspruchsvolle und 2-dimensionale Methoden zur Distanzbestimmung. Da aber viele biologisch relevante Moleküle, zum Beispiel biomolekulare Maschinen, genau in dieser Größenordnung liegen, ist es von höchster Wichtigkeit, eine simple 3-dimensionale Methode zur Hand zu haben, die diese Lücke schließt. Dazu wurde ein Algorithmus, basierend auf bildgebender kofokaler Mikrokopie, entwickelt, der es ermöglicht, kolokalisierte Farbstoffe über ihre Fluoreszenzlebensdauern und spektrale Charakteristika zu trennen. Die Genauigkeit und Anwendbarkeit der Methode wurde durch Eichmolekülen getestet. Dazu wurden verschieden lange DNA Moleküle, deren doppeltsträngiges Gerüst als sehr rigide bekannt ist, endständig mit den Farbstoffen Bodipy 630 und Cy 5.5 markiert und in einer Agarosematrix immobilisiert. Im Vergleich mit "Worm-like Chain"-Modellrechnungen zeigte sich, dass die gemessenen Längen gut mit dem Modell übereinstimmen. Weiterhin wurden Messungen in Zellen durchgeführt, die die Eignung der Methode in biologischer Umgebung bestätigen. Neben der Lokalisation von Biomolekülen rückt die quantitative Aufklärung komplexer zellulärer Einheiten immer weiter in den Vordergrund. Oftmals handelt es sich nicht mehr ausschließlich um die Bestimmung verschiedener Untereinheiten, die mit Hilfe unterschiedlicher Farbstoffe gegeneinander diskriminiert werden können, sondern um identische Moleküle, die in einem Zellkompartiment akkumulieren oder dort gebildet werden. Zum Beispiel findet die Ablesen der genetischen Information durch Polymerasen in sogenannten Transkriptionsfabriken statt. Eine typische HeLa-Zelle enthält etwa 8000 solcher 40 bis 80 nm großer Zentren, in denen sich durchschnittlich etwa 8 Polymerase II Enzyme befinden. Der Grund für die Akkumulation, ebenso wie die exakte Anzahl der Polymerasen, konnte mangels geeigneter Techniken bislang nicht aufgeklärt werden. Für das Verständnis der Zellfunktion ist es aber von Bedeutung, diese grundlegenden Einheiten zu untersuchen. Der erste Schritt in diese Richtung, die Zählung der Polymerase II Moleküle in Transkriptionsfabriken, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit durchgeführt werden. Um kolokalisierte Moleküle quantifizieren zu können, gibt es die Möglichkeit, Interphotonenzeiten, gemessen in Photon-Antibunching Experimenten, zu analysieren. Dazu werden Farbstoffe in einer mikroskopischen Abbildung lokalisiert, nachfolgend einzeln im Laserfokus positioniert und die Fluoreszenz bis zur Photozerstörung aufgenommen. Besonders die Carbopyronin-Derivate Atto 620 und Atto 647 stellten sich aufgrund ihrer hohen Photostabilität und Emissionsrate für die Experimente als geeignet heraus. Um die Eignung der Methode in zellulärem Umfeld zu prüfen, wurde Farbstoff markierte Oligomere, bestehend aus 40 Thyminen, in Zellen eingebracht. Es wurde gezeigt, dass diese selektiv und teilweise mehrfach an die bis zu 200 Basenpaar langen Adenosinenden der mRNA hybridisieren. Über Koinzidenzanalyse was es möglich bis zu vier Emitter in einem einzelnen Bildpunkt zu bestimmen. Um die Dichte von Trankriptionszentren in einem Bild zu erniedrigen und eine Molekülzählung für die 3.000 Transkriptionsfabriken pro Zellkern zu ermöglichen, wurden 100 nm dicke Zellschnitte eingesetzt. Die Polymerase II Moleküle wurden über spezifische farbstoffmarkierte Antikörper, die sich jeweils nur einfach an die Polymerasen binden, markiert. Eine Voraussetzung für den Erfolg des Experiments ist die stöchiometrische Kopplung der Farbstoffe an die Antikörper, d.h. es dürfen weder mehrfach noch unmarkierte Einheiten vorhanden sein. Hierzu wurde eine neue Methode entwickelt, die es erlaubt, eins zu eins markierte Proteine mittels einer affinen Gruppe herzustellen. Es konnte gezeigt werden, dass die Antikörper selektiv an ihr Ziel binden und erste wegbetreitende Experimente konnten an diesen Proben durchgeführt werden.