English Title: The regulated intramembrane proteolysis of the Amyloid Precursor Protein in Drosophila melanogaster

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Abstract

In unserer alternden Gesellschaft stellen neurodegenerative Krankheiten eine der größten Herausforderungen für die medizinische Forschung dar. Um effektive Therapieansätze entwickeln zu können, müssen die zellulären Mechanismen der Pathogenese verstanden werden. Der entscheidende Schritt in der Entstehung der Alzheimerschen Erkrankung ist die Produktion des Abeta-Peptids durch proteolytische Spaltung aus dem Vorläuferprotein APP. In den letzten Jahren konnten die verantwortlichen Proteasen identifiziert werden. Jedoch ist noch unklar, wie diese Proteine reguliert werden, vor allem im Kontext eines intakten Gewebes. In der vorliegenden Arbeit wurde der Modellorganismus Drosophila melanogaster verwendet, um diese Mechanismen weiter aufzuklären. Im ersten Teil der Arbeit wurden die Möglichkeiten eines genetischen Screens ausgenutzt, um durch Überexpression neue Gene zu finden, die die Prozessierung von APP beeinflussen. Da die Prozessierung von APP der Prozessierung des Rezeptors Notch sehr ähnlich ist, wurden für diesen Screen P-Element Insertionen verwendet, die bekanntermaßen den Signalweg von Notch modifizieren. Diese Vorauswahl hat es erlaubt, trotz einer geringen Zahl getesteter Gene neun Regulatoren der APP Prozessierung zu identifizieren. Zwei dieser Gene wurden molekularbiologisch charakterisiert. Die Kinase Hops/Tlk induziert die vollständige Degradation von APP, ohne dass sich proteolytische Fragmente anreichern. Obwohl gezeigt werden konnte, dass dieser Effekt spezifisch für APP ist, muss der zu Grunde liegende Mechanismus noch weiter aufgeklärt werden. Das Protein dBeach1 führt durch Veränderung der subzellulären Lokalisation von APP zur Akkumulation des alpha-geschnittenen Fragments. Dafür muss das für die Endozytose verantwortliche NPTY-Motiv in der intrazellulären Domäne von APP vorhanden sein. Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die subzelluläre Lokalisation des Vorläuferproteins von entscheidender Bedeutung für die Prozessierung ist. Der zweite Teil dieser Arbeit ging der Frage nach, wie in-vivo die Freisetzung der intrazellulären Domäne durch Intramembranproteolyse reguliert wird. Durch Verwendung eines GFP-basierten in-vivo Reportersystems konnte gezeigt werden, dass die Effizienz der gamma-Sekretase vermittelten Prozessierung von APP abhängig vom Zelltyp ist. In der larvalen Augenimaginalscheibe ist sie auf neuronale Zellen beschränkt. Diese Beschränkung beruht auf direkter Regulation der gamma-Sekretase. Durch den Vergleich verschiedener Substrate konnte gezeigt werden, dass es im Gegensatz zu einer gängigen Hypothese sowohl von der Länge der extrazellulären Domäne, als auch von der Aminosäuresequenz abhängt, ob ein Typ-I Membranprotein von der gamma-Sekretase umgesetzt werden kann. Die in-vivo Rekonstitution der gamma-Sekretase ergab Hinweise auf das Vorhandensein unterschiedlicher Proteasekomplexe mit distinkten Eigenschaften. Die Identifizierung neuer Regulatoren der APP-Prozessierung bietet nun die Möglichkeit, nach neuen pharmakologischen Angriffspunkten zu suchen. Schon länger wird versucht, Inhibitoren der gamma-Sekretase als Therapeutika einzusetzen, doch bisher führte der negative Einfluss auf andere Substrate der Protease zu schweren Nebenwirkungen. Sollten sich jedoch die Aktivitäten, die für die Prozessierung der einzelnen Proteine verantwortlich sind, voneinander trennen lassen, würde sich neue Hoffnung ergeben, die Produktion von Abeta ohne die Beeinträchtigung lebenswichtiger Signalwege inhibieren zu können.

Translation of abstract (English)

Neurodegenerative diseases are one of the major challenges for medical research in our ageing society. For the development of therapeutic treatments, it is crucial to understand the cellular mechanisms underlying the pathogenic events. The central step in the pathogenesis of Alzheimer’s disease is the production of the amyloidogenic Abeta peptide by proteolytic processing of the amyloid precursor protein. Although the responsible proteases have been identified in recent years, little is known about their regulation, especially in the context of an intact tissue. Do elucidate these mechanisms, Drosophila melanogaster was used as a model organism. In the first part of this thesis, a genetic screen was done to find new genes that upon overexpression alter the processing of APP. Because of the similarities between the processing of APP and the receptor Notch, P-elements were used that are known to interfere with this signaling pathway. This preselection allowed the identification of nine regulators of the APP processing. Two of these genes were molecularly characterized within this thesis. The kinase Hops/Tlk induces the complete degradation without accumulation of proteolytic fragments. It could be shown that this effect is specific for APP, but the molecular mechanism behind this needs to be studied in greater detail. The protein dBeach1 changes the subcellular localization of APP, which leads to the accumulation of a C-terminal fragment starting at the alpha-site. For this effect, the NPTY-motif, a signal for endocytosis, is needed in the intracellular domain of APP. Further experiments showed that the subcellular localization of the precursor protein is an important regulator of the proteolytic processing. In the second part of the thesis, the question was addressed how the gamma-secretase mediated release of the intracellular domain is regulated in-vivo. By using a GFP-based in-vivo reporter system it was found that the efficiency of APP processing depends on the cell type. In the larval eye imaginal disc, the intracellular domain is only released in neuronal cells. This restriction is caused by regulated gamma-secretase activity. The comparison of different substrates showed that in contrast to the current hypothesis, both the length of the extracellular domain and the amino acid sequence of a type-I transmembrane protein determine if it is cleaved by the protease complex. The reconstitution of the gamma-secretase in-vivo provided evidence for the existence of a heterogeneous family of complexes with distinct biological functions. The identification of novel regulators of the APP processing opens up new possibilities for the identification of pharmacological targets. For a long time, gamma-secretase inhibitors have been tested as therapeutics for Alzheimer’s disease. So far, the benefit of lowering Abeta production was always accompanied by the deleterious effects of simultaneously blocking essential signaling pathways. However, if it is possible to separate the activities responsible for the processing of each substrate, there will be new prospects of blocking the production of the amyloidogenic peptide without adverse side effects.