German Title: Molekulare Analyse der Unkonventionellen Exportmaschinerie von Galectin-1, einem beta-Galaktosid spezifischen Lektin der extrazellulären Matrix

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Abstract

Galectin-1 ist ein β-Galaktosid-spezifisches Lektin der extrazellulären Matrix, das an der Regulation verschiedener zellulärer Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt ist. Das extrazelluläre Auftreten von Galectin-1 war zunächst eine überraschende Entdeckung, da das Protein kein Signalpeptid enthält und somit nicht über ER/Golgi-vermittelten Transport sezerniert werden kann. Darüber hinaus ist die Sekretion von Galectin-1 in Gegenwart von Brefeldin A nicht gehemmt, so dass ein unkonventioneller Sekretionsweg postuliert wurde. In der vorliegenden Dissertation wurde ein robustes in vivo Modell zur funk¬tionellen Rekonstitution der Galectin-1 Sekretion etabliert. Es wurden mittels retroviraler Transduktion stabile Zelllinien generiert, die verschiedene Galectin-1 Reportermoleküle als GFP Fusionsproteine in Abhängigkeit von der exogenen Zugabe von Doxicyclin exprimieren. Da die exportierte Population über β-Galaktosid-haltige Rezeptoren an Zelloberflächen bindet, konnte die Galectin-1 Sekretionsrate über verschiedene Methoden wie Durchflusszytometrie, konfokale Laserscanmikroskopie sowie biochemische Zelloberflächenbiotinylierung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen quantifiziert werden. Die etablierten Modellsysteme wurden einerseits zur funktionellen Charakteri¬sierung eines in dieser Arbeit identifizierten Galectin-1 Rezeptors genutzt und andererseits zur Analyse der molekularen Sortierungsdeterminanten verwendet, die Galectin-1 zur entsprechenden Exportmaschinerie dirigieren. Eine systema¬tische Mutagenese des offenen Leserasters von Galectin-1 ergab hierbei, dass Mutationen, die zu einer Bindungsdefizienz führen, letztlich auch einen Exportdefekt verursachen. Komplementär hierzu konnte gezeigt werden, dass Galectin-1 von Zelllinien, die nicht zur Expression von β-Galaktosid-haltigen Rezeptoren befähigt sind, nicht exportiert wird. Hieraus wurde der Schluss gezogen, dass β-Galaktosid-haltige Zelloberflächenrezeptoren für den Gesamtprozess der Galectin-1 Sekretion essentiell sind. Dieser Befund konnte durch die Expression des mit Galectin-1 entfernt verwandten Proteins CGL-2 aus dem multizellulären Pilz Coprinopsis cinerea bestätigt werden. CGL-2 wird von Säugetierzellen unkonventionell exportiert, wobei dieser Prozess von der Bindung an β-Galaktosid-haltige Zelloberflächenrezeptoren abhängt. Die beschriebenen Arbeiten haben somit gezeigt, dass das primäre Sortierungssignal für die unkonventionelle Sekretion von Galectin-1 durch die β-Galaktosid-Bindungsstelle definiert ist und haben weitreichende Implikationen für die weitere Analyse der Galectin-1 Exportmaschinerie.

Translation of abstract (English)

Galectin-1 is a β-galactoside-specific lectin of the extracellular matrix that has been implicated in a number of important cellular processes such as the regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Even though galectin-1 occurs outside cells, it does not contain a signal peptide for ER/Golgi-mediated secretion and, therefore, unconventional mechanisms of galectin-1 export have been postulated. In the current thesis, a robust experimental model system has been established that allows for a precise quantitation of galectin-1 export from mammalian cells. Based on a retroviral transduction system, stable cell lines have been generated expressing various galectin reporter molecules as GFP fusion proteins using a doxicycline-dependent transactivator. As read out systems, flow cytometry, confocal microscopy and a biochemical cell surface biotinylation assay were used since exported galectins bind to cell surfaces via β-galactoside-containing counter receptors. This novel experimental system was used for two main purposes, one being the functional characterization of a novel galectin-1 counter receptor, the tumor-specific antigen CA125 that was identified in this study. A second aspect of the current thesis was to define molecular sorting determinants in galectin-1 that direct the protein to its unconventional export machinery. A systematic mutational analysis of the galectin-1 open reading frame was conducted. Additionally, surface residues as well as amino acids in galectin-1 conserved across species were exchanged by targeted mutation. A major outcome of these studies was that mutations causing a defect in galectin-1 binding to β-galactosides resulted in a loss of export competence. Intriguingly, when expressing the wild-type form of galectin-1 in mutant cells lacking β-galactoside-containing counter receptors, the protein also failed to get access to its export machinery. These findings were taken to mean that a functional interaction between galectin-1 and cell surface counter receptors is an obligatory step in the overall process of galectin-1 export. Consistently, despite being unrelated with regard to primary structure, a distant galectin relative from the fungus Coprinopsis cinerea, CGL-2, was shown to be exported from mammalian cells depending on its ability to bind to β-galactosides. Therefore, the work presented in this thesis demonstrates that the β-galactoside binding site represents the primary targeting motif for non-classical export of galectins defining a galectin export machinery that makes use of β-galactoside-containing surface molecules as export receptors for intracellular galectin-1. These results have a number of functional implications such as aspects of galectin folding during membrane translocation and with regard to the analysis of the subcellular site of membrane translocation that is now being investigated based on the results described above.