German Title: Funktionelle Charakterisierung eines mutmaßliche Calcium/Wasserstoff Austauschers pfcha von Plasmodium falciparum

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Abstract

SUMMARY Despite substantial efforts to control the spread of malaria, this infectious disease is still a major global health problem as chemotherapy of malaria parasites is limited by established drug resistance and lack of novel affordable treatment options. To combat malaria, identification and characterization of essential genes are needed. Although the calcium metabolism is very important in the life of P. falciparum, little is known about the genes which regulate the transport of calcium. With the release of the P. falciparum genome, a putative calcium hydrogen antiporter has been identified. To understand the role of this gene in the calcium metabolism of P. falciparum and to evaluate it as a drug target, we describe here the functional characterization by the heterologuous expression of this putative calcium hydrogen antiporter in Xenopus oocytes and in a S. cerevisiae strain which is deficient for the yeast vacuolar calcium hydrogen antiporter VCX1. The putative 441-residue protein, which we designate PfCHA, is predicted to contain 11 membrane-spanning segments and is related to the calcium exchanger family. Expression of pfcha in Xenopus oocytes resulted in a higher and pHdependent uptake of pfcha expressing oocytes, in comparison with control oocytes. External pH estimation showed that the calcium uptake was coupled to extrusion of protons out of the oocytes. In other experiments, we found that PfCHA has an antiport activity which is linear with time, unidirectional and electrogenic. Moreover PfCHA was inhibitable by La3+, a calcium transporter competitor, and was moderately inhibited by a sodium calcium exchanger inhibitor KB-R7943. This inhibitor showed also a moderate inhibition on parasite growth in culture. In contrast to the Xenopus oocytes, expression of pfcha in yeasts mutants defective in the Ca2+ transport resulted in a weakly complementat ion of the calcium tolerance. Our subcellular experiments suggested that PfCHA was localized to the yeast vacuole. These results confirm that PfCHA is a calcium hydrogen antiporter and we speculate that PfCHA could be a potential drug target. Further studies are needed to localize it in the parasite and to evaluate it as a drug target.

Translation of abstract (German)

ZUSAMMENFASSUNG Trotz erheblicher Bemühungen die Verbreitung von Malaria einzuschränken, stellt diese infektiöse Krankheit immer noch ein globales Gesundheitsproblem dar, da die Chemotherapie der Malariaparasiten durch Medikamentenresistenz erschwert wird und es einen Mangel an neuen erschwinglichen Behandlungsmethoden gibt. Um Malaria bekämpfen zu können, ist die Identizifierung und die Charakterisierung von essentiellen Genen erforderlich. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist deshalb der Calciummetabolismus, welcher bedeutend für den Lebenszyklus von P. falciparum ist. Bislang ist allerdings wenig über die beteiligten Gene bekannt, die den Transport von Calcium regulieren. Nach der Vervollständigung des Genoms von P. falciparum, wurde ein mutmaßlicher Ca2+/H+-Austauscher identifiziert. Um die Rolle dieses Gens im Calciummetabolismus von P. falciparum verstehen zu können und um zu untersuchen, ob dieser Transporter als möglicher Angriffspunkt für ein Medikament dienen könnte, wurde der mutmaßliche Ca2+/H+-Austauscher zur funktionellen Charakterisierung in den Oozyten von X. laevis sowie in S. cerevisiae exprimiert. Der verwendete Stamm von S. cerevisiae weist einen defekten vakuolären Ca2+/H+-Austauscher (VCX1) auf. Das 441 Aminosäuren umfassende Protein, welches als PfCHA bezeichnet wird, weist 11 vorhergesagte Transmembran-Domänen auf und gehört zur Familie der Ca2+/H+-Austauscher. Im Vergleich mit Kontroll-Oozyten, rief die Expression von pfcha in Oozyten von X. laevis einen höheren und pH-abhängigen Einstrom von 45Ca2+ hervor. Externe pH Messungen zeigten, dass die Calcium-Aufnahme in Oozyten an eine Extrusion von Protonen gekoppelt ist. Weitere Experimente zeigten, dass PfCHA eine Antiportaktivität aufweist, die linear zur Zeit, elektrogen und unidirektional verläuft. Außerdem konnte PfCHA sowohl durch La3+, ein Calciumtransporter-Inhibitor als auch durch den Na+/Ca2+-Austauscher-Inhibitor KBR7943 gehemmt werden, wobei die Hemmung durch KB-R7943 schwächer war. KBR7943 zeigte auch eine mittelstarke Inhibierung des Parasitenwachstums in der Kultur. Im Gegensatz zu pfcha-exprimierenden Oozyten von X. laevis ergab die Expression von pfcha in Hefemutanten, deren vakuolärer Ca2+/H+-Austauscher defekt ist, nur eine schwache Komplementierung der Calciumtoleranz. Weitere subzelluläre Experimente deuteten darauf hin, dass PfCHA in der Membran vom Hefevakuolen lokalisiert ist. Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Resultate bestätigen, dass PfCHA ein Ca2+/H+-Austauscher ist und es kann darüber spekuliert werden, dass PfCHA ein mögliches Angriffsziel für Medikamente sein könnte. Weitere Studien sind notwendig, um PfCHA im Parasiten zu lokalisieren und es als mögliches Medikamentenziel bewerten zu können.