German Title: Mechanismen der Signalübertragung von PI3K-gamma in T-Zellen

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Abstract

Phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks) are a family of lipid kinases involved in the regulation of diverse important cellular functions. The members of PI3K class I exhibit dual enzymatic specificity both as lipid kinases and protein serine kinases, and they are known to be indispensable for the development and proper functions of T lymphocytes. The involvement of PI3Ks in the activation of T cells is clearly demonstrated and so far mostly related to the PI3K class IA enzymes (alpha, beta and delta isoforms), but it was found that PI3Kgamma, the single member of class IB PI3K, is also involved in the regulation of activation-induced proliferation and cytokine production of T cells. How PI3Kgamma participates in this mechanism is largely elusive. Earlier reports proved that PI3Kgamma KO mice have a reduced number and an impaired differentiation of thymocytes, as well as a reduced number of CD4 T cells in spleen. We confirmed this earlier findings regarding disrupted differentiation of PI3Kgamma KO thymocytes, but in addition results presented here showed that this gene disruption had an even stronger impact on the mouse phenotype, significantly reducing the number of T cells in spleen and lymph nodes and effecting both major subpopulations of mature T cells (CD4 and CD8 cells). In published studies PI3Kgamma KO T cells showed reduced proliferation upon T cell receptor (TCR) stimulation. Costimulation with specific anti-CD28 antibody or activation with Ionomycin and phorbol ester is able to rescue this proliferation, in contrast to subsequent interleukin-2 (IL-2) and interferon-gamma production. In our experiments IL-2 costimulation of TCR-activated PI3Kgamma KO T cells was also sufficient to rescue this impaired proliferation, which clearly implicated that the lack of cytokines may be the major cause of their functional defect. In order to elucidate how PI3Kgamma couples the activation of TCR and IL-2 production in Jurkat cells, we used the PI3Kgamma specific inhibitor AS041164. In our experimental settings AS041164 did not exhibit any detectable cytotoxicity within the applied concentration range. Furthermore, this substance had no significant influence on overall PI3K activity in Jurkat cells proving its selectivity and specificity in our model. The results obtained by applying AS041164 on Jurkat cells implicated that PI3Kgamma may not be involved in the signalling events in the proximity of activated TCR, and that PI3Kgamma is dispensable for certain aspects of T cell activation, such as CD69 expression. Nevertheless, treatment with AS041164 clearly and reproducibly reduced IL-2 production of activated Jurkat cells in dose-dependent manner. Jurkat cells have constant high level of PIP3, the major product of PI3K lipid-kinase activity; therefore it is most likely that this effect was caused by a lack of PI3Kgamma protein kinase-activity. PI3Kgamma specifically interactions with several isoforms of protein kinase C (PKC) in Jurkat cells were also proved in this thesis. These interactions seem to be important for the proper function of interacting PKC isoforms upon T cell activation and for the subsequent IL-2 production. Finally, our results showed that PI3Kgamma may be involved in the control of IL-2 production on several levels from transcription to secretion, and one of these levels is apparently PKC-related. In conclusion, results from this thesis clearly demonstrate that PI3Kgamma is an important modulator of thymocyte proliferation and differentiation. Moreover, PI3Kgamma is necessary for the TCR-induced IL-2 production, a process known to be crucial for the normal proliferation of T cells after antigen receptor activation. PI3Kgamma interacts with several PKC isoforms and modulate their activity upon TCR engagement, which is necessary for the IL-2 production. Described interactions depend on overall PI3K lipid-kinase activity as well as PI3Kgamma protein-kinase activity. This various modes of protein-protein interactions and kinase activity clearly show the PI3Kgamma is a multifunctional enzyme important for proper development and function of lymphocytes.

Translation of abstract (German)

Phosphorinositol-3- Kinasen (PI3Ks) gehören zu einer Lipidkinasenfamilie, die an der Regulation verschiedener zellulärer Funktionen beteiligt ist. Die Enzyme der PI3Ks Klasse I besitzen eine doppelte Spezifität, sowohl als Lipidkinasen, als auch als Proteinserinkinasen. Sie sind dafür bekannt bei der Entwicklung und Funktion von T- Lymphozyten unverzichtbar zu sein. Die Beteiligung der PI3Ks an der Aktivierung von T-Zellen wurde hauptsächlich den PI3K IA Klasseenzymen (alpha, beta und delta Isoformen) zugeordnet. Man entdeckte jedoch, dass PI3K-gamma, ein einzelnes Mitglied der PI3K IB Klasse, auch bei der Regulation der durch Aktivierung induzierten Proliferation und Zytokinproduktion der T- Zellen eine Rolle spielt. In welcher Weise PI3K-gamma an diesem Mechanismus beteiligt ist, ist in großen Teilen noch nicht bekannt. Aus früheren Experimenten mit PI3K-gamma Knockout Mäuse ist bekannt, dass diese sowohl eine geringere Anzahl und eine eingeschränkte Differenzierung der Thymozyten, als auch eine verringerte Zahl CD4+ T-Zellen in der Milz aufweisen. Wir konnten diese frühere Endeckungen, die die gestörte Differenzierung in PI3K-gamma KO Thymozyten betreffen, bestätigen, jedoch belegen unsere hier dargestellten Ergebnisse auch, dass diese Gendisruption sogar einen stärkeren Einfluss auf den Mausphänotyp hat. So kommt es zu einer signifikanten Verringerung der T- Zellen in der Milz und den Lymphknoten und zu einer Beeinflussung beider Hauptpopulationen reifer T- Zellen (CD4+ und CD8+ Zellen). In publizierten Studien zeigten PI3K-gamma KO T- Zellen eine reduzierte Proliferation bezüglich der T-Zellrezeptor (TCR) Stimulation. Eine CD28 Kostimulation oder eine Aktivierung mit Ionomycin und Phorbolester ist in der Lage diese gestörte Proliferation, im Gegensatz zu anschließenden Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-gamma Produktion, aufheben. In unseren Experimenten war auch eine IL-2 Kostimulation der TCR- aktivierten PI3K-gamma KO T- Zellen fähig, die gestörte Proliferation wiederherzustellen, was deutlich zeigt, dass ein Fehlen der Zytokine die Hauptursache ihres funktionellen Defektes sein könnte. Um aufzuklären, auf welche Weise PI3K-gamma die Aktivierung des T- Zellrezeptors mit der IL-2 Produktion in Jurkat Zellen verbindet, wurde der spezifische PI3K-gamma Inhibitor AS041164 verwendet. In unserem experimentellen Rahmen wies AS041164 in der applizierten Konzentrationsbreite keine detektierbare Zytotoxizität auf. Die Substanz hat keinen signifikanten Einfluss auf die PI3K Gesamtaktivität in Jurkatzellen, was ihre Selektivität in unserem Modell beweist. Die mit dem spezifischen Inhibitor AS041164 erzielten Ergebnisse implizieren, dass PI3K-gamma nicht in Signalwege in der Nähe des aktivierten TCRs verwickelt ist, und dass das Enzym für bestimmte Aspekte der T-Zellaktivierung, wie die CD69 Expression, verzichtbar ist. Dennoch verringerte die Behandlung mit AS041164 deutlich und reproduzierbar die IL-2 Produktion in aktivierten Jurkat Zellen in einer dosisabhängigen Weise. Jurkat Zellen besitzen einen konstant hohen Spiegel an PIP3, dem Hauptprodukt der PI3K Lipidkinase Aktivität, daher ist es am wahrscheinlichsten, dass dieser Effekt durch ein Fehlen der Proteinkinase Aktivität der PI3K-gamma verursacht wird. Im Rahmen der Arbeit wurde klar gezeigt, dass PI3K-gamma spezifisch mit verschiedenen Isoformen der Proteinkinase C (PKC) in Jurkatzellen interagiert. Es hat den Anschein als seien diese Interaktionen für die richtige Funktion der interagierenden PKC Isoformen bei der T- Zellaktivierung und für die IL-2 Produktion wichtig. Abschließend zeigen unsere Ergebnisse, dass PI3K-gamma in die Kontrolle der IL-2 Produktion auf verschiedenen Ebenen von der Transkription bis zur Sekretion verwickelt ist und dass eine dieser Ebenen anscheinend mit der PKC zusammenhängt. Zusammengefasst zeigt diese Studie klar, dass PI3K-gamma ein wichtiger Modulator der Thymozytenproliferation und- differenzierung ist. Darüber hinaus ist PI3K-gamma für die TCR- induzierte IL-2 Produktion wichtig, einem Prozess, der entscheidend für die normale T- Zellproliferation nach der Antigen- Rezeptor Aktivierung ist. PI3K-gamma interagiert mit verschiedenen PKC Isoformen und moduliert ihre Aktivität bezüglich der TCR Bindung, was für die IL-2 Produktion nötig ist. Die beschriebenen Interaktionen hängen sowohl von der gesamten PI3K Lipidkinase Aktivität, als auch von der PI3K-gamma Proteinkinase Aktivität ab. Diese verschiedenen Arten von Protein- Protein Interaktion und Kinase Aktivität zeigen klar, dass PI3K-gamma ein multifunktionales Enzym ist, das für eine ordnungsgemäße Entwicklung und Funktion von Lymphozyten wichtig ist.