English Title: Interaction of posttranscriptional modifications and structures of human mitochondrial tRNAs

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Abstract

Zusammenfassung Mitochondrien sind Organellen eukaryotischer Zellen, die für die Energieproduktion der Zellen verantwortlich sind, sowie über ein eigenes Genom verfügen. Das menschliche mitochondriale Genom kodiert 13 Proteine für die Untereinheiten der Atmungskettenkomplexe und 22 transfer RNAs (tRNAs). Mehr als 80 verschiedene Punktmutationen in den humanen mitochondrialen tRNA Genen werden mit Krankheiten wie Kardiopathie, Enzephalopathie und Myopathien assoziert. Die Bildung von alternativen sekundären und tertiären tRNA-Strukturen könnte die Pathogenität dieser Mutationen erklären. Um Informationen über die strukturelle Dynamik der humanen mitochondrialen tRNAs und über pathogene Mutanten (tRNALys-WT, -A8344G, tRNASer(UCN)-WT, -G7497A, -T7512C, tRNAGln-WT, -T4336C, tRNALeu(CUN)-WT, -A12320G, -G12315A) zu bekommen, wurde die Struktur von in vitro Transkripten mit folgenden Methoden genauer untersucht: chemische und enzymatische Kartierung, UV-Schmelzkurvenanalyse und elektrophoretische Mobilität auf nativen Gelen, sowie posttranskriptionelle Modifikation mit Enzymen aus humanen mitochondrialen Extrakten und aus Saccharomyces cerevisiae (scPus1p und scPus4p). Folgende Ergebnisse wurden dabei gewonnen: enzymatische und chemische Kartierungsdaten und UV-Schmelzkurvenanalyse zeigen, dass die A12320G und G12315A Mutanten der tRNALeu(CUN) eine ungewöhnliche Struktur besitzen, die sich vom Wildtyp deutlich unterscheidet. In humaner mitochondrialer tRNASer(UCN) führt die G7497A Mutation zu einer stark kompaktierten Struktur, was durch temperaturabhängige Strukturanalyse gezeigt wurde. Das durch diese Mutation eingeführte G•U Wobble-Paar im D-Stem hat einen negativen Einfluss auf die Erkennung sowohl durch humane mitochondriale Enzyme, als auch durch Pus4 und Pus1 aus S.cerevisiae. Die strukturelle Dynamik von nicht-modifizierten und teilmodifizierten Transkripten, die mit UV-Schmelzkurven analysiert wurden, zeigt, dass posttranskriptionelle Modifikationen eine wichtige Rolle in der strukturellen und wahrscheinlich auch in der metabolischen Stabilität dieser tRNA spielen. Die Studien der pathogenen G7497A Punktmutation in Osteosarcoma Zellen zeigen, dass untermodifizierte tRNAs instabil sind und in der Zelle schnell abgebaut werden. Es wurde eine Reduktion zur Verfügung stehender funktioneller tRNAs in Mitochondrien auf 10 % gefunden, was zu einer Verminderung der Proteinsynthese um 40 % führt [Mollers et al., 2005]. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die meisten pathogenen Mutationen im Kernbereich der tRNA deren Struktur signifikant beeinflussen. Mit Ausnahme einer Mutation T4336C in tRNAGln, welche die Aktivität von Pseudouridin-Synthase im Vergleich zu dem Wildtyp erhöhte, zeigten die meisten pathogenen Mutationen eine Verringerung der Aktivität von den Modifikationsenzymen.

Translation of abstract (English)

Summary Mitochondria are intracellular organelles responsible for the majority of a cell’s energy production. The human mitochondrial genome encodes 13 proteins for subunits of the respiratory chain complexes and 22 transfer RNAs (tRNAs). More than 80 different point mutations in human mitochondrial tRNA genes are correlated with severe disorders, including fatal cardiopathies, encephalopathies, myopathies, and others. The formation of alternative secondary and tertiary structures of mutant tRNAs could explain their pathogenicity. To obtain information about the structural dynamics of the secondary and tertiary structures of human mitochondrial tRNAs and their mutants (tRNALys-WT, -A8344G, tRNASer(UCN)-WT, -G7497A, -T7512C, tRNAGln-WT, -T4336C, tRNALeu(CUN)-WT, -A12320G, -G12315A), we have analysed the structure of their in vitro transcripts using the following biochemical methods: chemical and enzymatic probing of RNA, UV-melting curves, nondenaturating gelelectrophoresis and post-transcriptional modification with mitochondrial extracts, Pus1 and Pus4 from Saccharomyces cerevisiae. Results of enzymatic and chemical probing and also of UV-melting curve measurements suggest that boths mutants of tRNALeu(CUN), A12320G and G12315A, possess an unusual structure compared to the wild-type. The mutation G7497A, which leads to a C to U transition, changes a G-C pair in the D-stem of the tRNASer(UCN) into a G•U wobble pair. It was shown that this causes a dramatic decrease of the steady-state level of functional tRNA molecules below 10 %, as well as a 40 % lower rate of protein synthesis [Mollers et al., 2005]. The chemical and enzymatic RNA probing at different temperatures suggests that the mutant exhibits an unusual structure, which is also apparent in nondenaturating gel electrophoresis experiments. The structural disturbance introduced by the wobble-pair was also shown to affect recognition by modification enzymes including Pus4 and Pus1 from S.cerevisiae. The structural dynamics of partial modified and unmodified in vitro transcripts were analysed by UV-melting curves. These experiments suggest an important role of post-transcriptional modifications in structural and, likely, metabolic stability of this tRNA. In summary, our results showed that most mutations in the core-region of tRNA significantly affect the tRNA structure. Examination of post-transcriptional modification of human mitochondrial tRNAs and their pathogenic mutants with a mitochondrial extract showed a reduction in the modification levels of all mutants, except tRNAGln-T4336C, that lead to increase of pseudouridine synthase activity.