German Title: Die Aufdeckung Barcode-ähnlicher Muster als Ergebnis toxikogenomischer Untersuchungen im Zebrafischembryo

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Abstract

There is an increasing demand by regulators, pharmaceutical manufacturers and industry for reliable and ethically acceptable model systems to assess and predict the toxicity of pharmaceutical products, chemicals, and waste. In particular, developmental toxicity of compounds has largely been ignored in the past raising massive concerns. While cell lines have great merits as test systems, they do not reflect the complexity of a developing embryo. Zebrafish and their embryos have been used in toxicity assays in the past and have a great potential for studying reproductive toxicity and the molecular basis of developmental toxicity. Toxicogenomics is a powerful tool for compound classification based on mechanistic studies, which could eventually lead to the prediction of the toxicity of novel compounds. I have carried out here a systematic toxicogenomic study of zebrafish embryos with the aim to develop this system further as a model for molecular developmental toxicity studies. Questions such as stage- and compound specificity were addressed. The toxicogenomic responses to a series of 6 test compounds were highly stage-dependent. Moreover, exposure of late embryonic stages between 96 and 120 hours post-fertilisation induced transcriptional profiles that are characteristic for specific compounds. This leads to the identification of 199 genes that are induced by at least one of the 11 compounds including a number of signature genes that appear specific for individual compounds or compound groups within the set of chemicals investigated. Moreover, I have tested whether one can observe toxicogenomic responses in the absence of apparent morphological effects. In several instances robust gene responses were measured at concentrations that did not have obvious morphological effects. This raises hopes that toxicogenomic studies in the zebrafish embryo could be used to predict chronic effects of low level exposure. In situ hybridisation of a number of selected genes showed that the responses can be highly tissue restricted indicating that the whole mount protocol developed here is highly sensitive. In conclusion, this toxicogenomic analysis, demonstrated that zebrafish embryos may be suitable to study the transcriptional responses to toxicants with high specificity and more sensitivity. The zebrafish may thus be developed into a system that will not only help to elucidate the molecular mechanisms of toxicity but may be also useful to predict the developmental toxicity of novel chemicals by comparison of toxicogenomic profiles.

Translation of abstract (German)

Der Bedarf seitens Regulatoren, pharmazeutischer Hersteller und der Industrie an verlässlichen und ethisch vertretbaren Modellsystemen zur Bewertung und Vorhersage der Toxizität pharmazeutischer Produkte, Chemikalien und von Abfall steigt beständig. Insbesondere die Entwicklungstoxizität von Verbindungen wurde in der Vergangenheit weitestgehend ignoriert, wodurch massive Bedenken aufkamen. Zelllinien besitzen eine hohen Stellenwert als Test Systeme, reflektieren aber nicht die Komplexität eines Embryos. Zebrafische und deren Embryonen wurden bereits für Toxizitäts-Assays eingesetzt und besitzen großes Potential, um Reproduktionstoxizität und die molekulare Grundlage der Entwicklungstoxizität zu untersuchen. Die Toxikogenomik liefert ein leistungsfähiges Instrument zur Verbindungs-Klassifizierung basierend auf mechanistischen Studien, wodurch letztlich eine Toxizitäts-Prognose neuer Verbindungen möglich wird. Ich habe in der vorliegend Arbeit eine systematische toxikogenomische Studie an Zebrafischembryonen mit dem Ziel durchgeführt, dieses Testsystem zu einem Modell für Studien molekularer Entwicklungstoxizität weiterzuentwickeln. Fragen der Spezifität bezüglich Stadium und Verbindung wurden behandelt. Die toxikogenomische Antwort auf eine Serie von 6 Verbindungen erwies sich als hochgradig abhängig vom Stadium. Darüber hinaus wurden nach Exposition später embryonaler Stadien zwischen 96 und 120 Stunden nach der Befruchtung Transkriptions-Profile induziert, welche charakteristisch für spezifische Verbindungen waren. Dies führte zur Identifizierung von 199 Genen, die zumindest durch eine von 11 Verbindungen induziert wurden, inklusive einer Reihe von Genen, welche sich als spezifisch für individuelle Verbindungen oder Verbindungs-Klassen erwiesen. Weiterhin habe ich untersucht, ob die Beobachtung einer toxikogenomischen Antwort ohne sichtbaren morphologischen Effekt möglich ist. In einigen Beispielen konnten stabile Gen-Antworten in Konzentrationsbereichen gemessen werden, bei denen keine offensichtlichen morphologischen Effekte auftraten. Dies lässt hoffen, dass toxikogenomische Studien an Zebrafischen-Embryonen zur Prognose chronischer Toxizität nach Exposition mit geringen Konzentrationen eingesetzt werden können. In situ-Hybridisierungen von einer Reihe ausgewählter Gene haben gezeigt, dass die Antworten hohe Gewebespezifität zeigen, was ein hohes Mass an Sensitivität des hier entwickelten „whole-mount“ Protokolls indiziert. Schließlich zeigen die toxikogenomischen Analysen, dass sich Zebrafisch-Embryonen zur Untersuchung transkriptioneller Antworten auf Toxine mit hoher Spezifität und Sensitivität eignen. Der Zebrafisch kann daher möglicherweise zu einem System entwickelt werden, dass nicht nur bei der Aufklärung der molekularen Toxizitäts-Mechanismen hilft, sondern auch in der Prognose der Entwicklungstoxizität neuer Chemikalien durch Vergleich von toxikogenomischen Profilen nützlich sein kann.