German Title: Quantitative Analyse des Hepatitis C Virus Replikationskomplexes und Identifikation assoziierter zellulärer Faktoren

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Abstract

Hepatitis C virus (HCV) has a positive-strand RNA genome and is grouped into the family of Flaviviridae. Similar to other positive-stranded RNA viruses, HCV RNA replication takes place in the cytoplasm. The sites of viral replication are designated “membranous web” and represented by an accumulation of vesicular structures, which are induced by the viral non-structural proteins and probably originate from membranes of the Endoplasmic Reticulum. The aim of this work was to purify and characterize these viral replication complexes (RCs) in vitro and to identify potential host factors of viral replication. First a purification strategy for enzymatically active viral replication complexes was developed to determine associated cellular proteins by proteomics. Thereby, several potential host factors of viral replication were identified and the most reproducible, Annexin II (ANXA2) was further characterized. In immunofluorescence analyses, ANXA2 strongly colocalized to the sites of viral replication in all applicable cell lines supporting HCV replication, in HCV-transfected as well as in infected cells. In contrast, we found no obvious colocalization of HCV proteins with Annexin I, IV or V or with p11 (also denoted S100A10), a common cellular ligand of Annexin II. Specificity of the ANXA2-HCV interaction was further indicated by the lack of colocalization with replication sites of other positive-strand RNA viruses, namely Dengue virus and Semliki-Forest-Virus. By individual expression of the viral non-structural (NS) proteins we found that NS5A colocalized with Annexin II, indicating that NS5A might be involved in the recruitment of ANXA2. SiRNA-mediated silencing clearly reduced Annexin II levels but failed to block HCV replication. However, FACS analyses revealed a strong correlation of intracellular HCV and ANXA2 levels even in presence of ANXA2 siRNA, suggesting that Annexin II expression was induced by HCV, thereby counteracting siRNA-mediated knockdown. Still, ANXA2 silencing moderately reduced the number of HCV positive cells. Interestingly, the presence of replicating HCV sequences in HepG2 cells, harboring very little endogenous ANXA2, clearly induced Annexin II expression to detectable levels perfectly colocalizing with the viral NS proteins. However, the role and function of ANXA2 in the HCV life cycle has yet to be defined. In a second line of investigations, a detailed stoichiometric analysis of HCV RCs was performed. Thus, the ratio of non-structural proteins to RNA that is required for HCV RNA replication could be determined. Almost the entire negative- and positive-strand RNA but <5% of the non-structural proteins present in HCV-harboring cells were protected against nuclease and protease treatments. Nevertheless, this protease-resistant portion of NS proteins accounted for the full in vitro replicase activity. Therefore, only a minor fraction of the HCV non-structural proteins was actively involved in RNA synthesis. However, due to the high amounts present in replicon cells, this still represented a huge excess compared to the viral RNA. Based on the comparison of nuclease-resistant viral RNA to protease-resistant viral proteins, an active HCV replication complex probably consists of one negative-strand RNA, two to ten positive-strand RNAs, and several hundred non-structural protein copies. These might be required as structural components of the vesicular compartments that are the site of HCV replication.

Translation of abstract (German)

Das Hepatitis C Virus (HCV) besitzt ein Plusstrang-RNA-Genom und gehört zur Familie der Flaviviridae. Die HCV RNA-Replikation findet, ähnlich wie bei anderen Plusstrang-RNA-Viren, im Zytoplasma statt. Die Stätten der viralen Replikation werden als „membranous web“ bezeichnet und repräsentieren eine Anhäufung vesikulärer Strukturen, die durch die viralen Nichtstruktur-Proteine induziert werden und wahrscheinlich den Membranen des Endoplasmatischen Retikulums entstammen. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl die Reinigung und Charakterisierung dieser viralen Replikations-Komplexe (RC) in vitro als auch die Identifikation möglicher Wirtsfaktoren der viralen Replikation. Als Erstes wurde eine Reinigungsstrategie für enzymatisch aktive virale Replikations-Komplexe entwickelt, um assoziierte zelluläre Proteine durch Proteom-Analysen zu ermitteln. Einige potentielle Wirtsfaktoren der viralen Replikation konnten dadurch identifiziert werden, und der am häufigsten reproduzierbare, Annexin II (ANXA2), wurde eingehend charakterisiert. Immunfluoreszenz-Studien zeigten, dass in allen geeigneten, HCV-Replikation unterstützenden Zelllinien, in HCV-transfizierten sowie infizierten Zellen, ANXA2 deutlich mit den Stätten der viralen Replikation kolokalisiert. Im Gegensatz dazu fanden wir weder eine ersichtliche Kolokalisation von HCV-Proteinen mit Annexin I, IV, oder V, noch mit p11 (auch S100A10 genannt), einem häufigen zellulären Liganden von Annexin II. Die Spezifität der ANXA2-HCV Interaktion wurde noch betont durch die fehlende Kolokalisation mit Replikations-Stätten anderer Positiv-Strang-RNA-Viren wie Dengue Virus und Semliki-Forest-Virus. Durch die individuelle Expression viraler Nicht-Struktur- (NS-) Proteine fanden wir heraus, dass NS5A mit Annexin II kolokalisiert, was darauf hinweist, dass NS5A möglicherweise in die Rekrutierung von ANXA2 involviert ist. SiRNA-vermitteltes silencing reduzierte die Annexin II-Menge deutlich, führte jedoch nicht zur Hemmung der HCV Replikation. FACS-Analysen zeigten hingegen eine starke Korrelation von intrazellulären HCV- und ANXA2-Mengen, auch in Anwesenheit von ANXA2-siRNA. Daher ist anzunehmen, dass NS5A die ANXA2-Expression induziert, wodurch dem siRNA-vermittelten knockdown entgegengewirkt wird. Dennoch reduzierte ANXA2-Silencing moderat die Anzahl HCV-positiver Zellen. Interessanterweise verursachte die Anwesenheit replizierender HCV-Sequenzen in HepG2-Zellen, die äußerst wenig endogenes ANXA2 besitzen, eine ANXA2-Expression von deutlich nachweisbaren Mengen, welche mit den viralen NS-Proteinen perfekt kolokalisierten. Die Rolle und die Funktion von ANXA2 im HCV-Lebenszyklus müssen allerdings noch definiert werden. Als Zweites wurde eine detaillierte stöchiometrische Analyse der HCV-Replikations-Komplexe durchgeführt. Auf diese Weise konnte das für die HCV-RNA-Replikation erforderliche Verhältnis von NS-Proteinen zu RNA ermittelt werden. Fast die gesamte Negativ- und Positiv-Strang-RNA, jedoch <5% aller Nicht-Struktur-Proteine, die in HCV-replizierenden Zellen vorhanden sind, waren gegen Nuklease- und Protease-Behandlungen geschützt. Dennoch war dieser Protease-resistente Anteil der NS-Proteine für die gesamte in vitro Replikase-Aktivität verantwortlich. Folglich war nur eine kleinere Fraktion der HCV Nicht-Struktur-Proteine aktiv an der RNA-Synthese beteiligt. Allerdings machte dies aufgrund der in Replikon-Zellen vorhandenen großen Mengen verglichen mit viraler RNA immer noch einen enormen Überschuss aus. Basierend auf dem Vergleich Nuklease-resistenter viraler RNA zu Protease-resistenten viralen Proteinen enthält ein aktiver HCV Replikations-Komplex wahrscheinlich eine Negativ-Strang-RNA, zwei bis zehn Positiv-Strang-RNA-Moleküle und einige hundert Kopien der Nicht-Struktur-Proteine. Diese werden möglicherweise als strukturelle Komponenten der vesikulären Kompartimente benötigt, welche die Stätten der HCV Replikation repräsentieren.