English Title: Subcellular distribution of the central clock protein FREQUENCY within the circadian clock of Neurospora crassa

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Abstract

Die circadianen Uhren eukaryontischer Organismen bestehen aus einem Netzwerk miteinander verknüpfter Rückkopplungsschleifen. Ein grundlegendes Prinzip darin ist eine negative Transkriptions-Translations-Rückkopplungsschleife, in der ein Protein die Transkription seiner eigenen mRNA zeitverzögert reprimiert. Daher spielt die Regulation der nukleocytoplasmatischen Verteilung einzelner Proteine im molekularen Mechanismus der Uhren eine wichtige Rolle. FREQUENCY (FRQ) ist eine der zentralen Komponenten der circadianen Uhr von Neurospora crassa. Es hemmt zum einen im Zellkern die Transkription seiner eigenen mRNA (negative Rückkopplung), zum anderen fördert es im Cytosol die Bildung des White Collar Komplexes (WCC) bestehend aus den Transkriptionsfaktoren White Collar (WC) 1 und 2 (positive Rückkopplung), der wiederum die Transkription von frequency-mRNA bewirkt. Die zeitliche Abfolge beider Funktionen ist exakt festgelegt, daher muss die subzelluläre Verteilung von FRQ präzise reguliert werden. Um das korrekte Funktionieren der Uhr zu gewährleisten, ist FRQ zum größten Teil im Cytosol und nur zum kleineren Teil im Zellkern lokalisiert, obwohl es ein funktionales Kernlokalisationssignal (NLS) besitzt. frq9 exprimiert durch Leserasterverschiebung ein um ca. 30% C-terminal verkürztes Protein (FRQ9), das überwiegend im Zellkern vorkommt. Der C-Terminus ist also für die unerwartete cytoplasmatische Lokalisation von FRQ verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, welche Teile des C-Terminus die FRQ-Lokalisation beeinflussen und wie die subzelluläre Verteilung bewirkt wird. Die Verteilung kann nicht einer eng umgrenzten Region (z. B. einem putativen Kernexportsignal, NES) im C-Terminus zugeschrieben werden und spiegelt sehr wahrscheinlich ein dynamisches Gleichgewicht aus Kernimport und -export wider. Ein Teil der FRQ-Population könnte durch Modifikation im Zellkern diesem shuttling-Prozess entzogen werden, so dass er nicht wieder in den Zellkern gelangen kann (z. B. durch Maskierung eines Kernlokalisationssignals, NLS). Phosphorylierungen sind ein wichtiger Regulationsmechanismus für FRQ-Funktionen und könnten auch an der Festlegung der subzellulären Lokalisation beteiligt sein. Um in vivo-Phosphorylierungsstellen und Bindungspartner von FRQ massenspektrometrisch identifizieren zu können, wurden verschiedene Affinitätschromatographiemethoden auf ihre Verwendbarkeit in N. crassa getestet. Eine einzelne Methode führte in keinem Fall zu ausreichender Anreicherung von FRQ, aber eine Doppelstrategie aus His6/Ni2+- und StrepTag II/StrepTactin-Aufreinigung erscheint viel versprechend, da beide das Protein aus Totalextrakten depletieren können und die Puffer miteinander kompatibel sind. Schließlich wird ein Satz neuer Expressionsvektoren für die Transformation von N. crassa vorgestellt. Jeder dieser Vektoren komplementiert die Histidinauxotrophie der his-3-Mutante und besitzt einen N. crassa-Promotor, einen Polylinker sowie einen Transkriptionsterminator mit Polyadenylierungsstelle.

Translation of abstract (English)

Eukaryotic circadian clocks are made up by networks of interconnected feedback loops. One basic principle therein is a transcriptional-translational negative feedback loop in which a protein represses with a time delay transcription of its own mRNA. Therefore, regulation of nucleo-cytoplasmic partitioning of distinct proteins plays an important role in the clocks’ molecular mechanisms. FREQUENCY (FRQ) is one of the central components of the Neurospora crassa circadian clock. On the one hand, it represses in the nucleus transcription of its own mRNA (negative feedback). On the other hand, it promotes in the cytosol accumulation of White Collar Complex (WCC) consisting of the transcription factors White Collar (WC) 1 and 2 (positive feedback) which in turn causes transcription of frq mRNA. The temporal order of both functions is exactly determined so subcellular distribution of FRQ needs to be regulated precisely. To ensure proper functioning of the clock, most of the protein localises to the cytosol and only a minor portion is in the nucleus although FRQ contains a functional nuclear localisation signal (NLS). frq9 expresses — due to a frame shift mutation — an approx. 30% C-terminally shortened protein (FRQ9). FRQ9 appears predominantly in the nucleus so the C-terminus accounts for the unexpected cytosolic localisation of FRQ. This study examines which parts of the C-terminus determine localisation and how the subcellular distribution is achieved. FRQ distribution cannot be attributed to a closely confined region in the C-terminus (e.g. a putative nuclear export signal, NES) and presumably reflects a dynamic equilibrium of nuclear import and export. Phosphorylation in the nucleus may withdraw a part of the FRQ population from this shuttling process so it cannot enter the nucleus again (e. g. by masking of the nuclear localisation signal, NLS). Phosphorylation is an important mechanism regulating FRQ functions and may be involved in determining subcellular localisation as well. In order to identify in vivo phosphorylation sites and binding partners by mass spectrometry several affinity chromatography methods were tested for their applicability with Neurospora. One single method has not proven to be sufficient for proper FRQ enrichment but a double strategy of His6/Ni2+ and StrepTag II/StrepTactin purification seems promising since both can deplete the protein from total extracts and their buffers are compatible with each other. Finally, a new set of expression vectors for N. crassa transformation is presented. Each vector complements histidine auxotrophy of the his-3 mutant and contains a N. crassa promoter, polylinker and a transcriptional terminator with polyadenylation site.