English Title: De- and Retargeting of adenoviral vectors

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Abstract

Im Fokus dieser Arbeit stand die Modifikation des Tropismus von Adenovirus Subtyp 5 (Ad5) durch De- und Retargeting. In Infektions- und Kompetitionsexperimenten mit verschiedenen Dauerzellen und Primärzellen wurden die Wechselwirkungen von Ad5 mit seinen natürlichen Rezeptoren untersucht. Hierbei wurde ein in-vitro 2-Komponenten-Kompetitionssystem etabliert, auf dessen Basis gezeigt werden konnte, dass Ad5 auf allen analysierten Zelllinien neben CAR (Coxsackievirus-Adenovirus-Receptor) und HSPG (Heparansulfatproteoglykane) keine weiteren natürlichen primären Rezeptoren für die Infektion effizient nutzt. Beide Aufnahmemechanismen zeigen einen synergistischen Effekt bei der Vermittlung der Transduktion. Im Rahmen des Detargetings wurden Kontaktaminosäuren modifiziert, die eine Rolle bei der Interaktion mit CAR spielen und im Kontext „pseudogetypter“ Viren untersucht. Die Grundlage zur Herstellung pseudogetypter adenoviraler Partikel war das genomisch fiberlose Konstrukt Ad5.GFP.DF/F+, welches in einem etablierten transienten Transfektions- und Infektionssystem mit modifizierten Fibern phänotypisch mit modifizierten Fibern ausgestattet wurde. Die Daten zeigen, dass der gleichzeitige Austausch der beiden Aminosäuren S408E/P409A innerhalb der Fiber die Interaktion mit CAR soweit herabsetzt, dass auch zusätzliche Modifikationen diesen Effekt nicht weiter verstärken. Auf der Grundlage eines SP-modifizierten Fiberproteins wurden dann verschiedene Peptide mit einer potentiellen Spezifität für koronale glatte Muskelzellen in den exponierten HI-Loop der Fiber eingeführt und der Einfluss dieser Peptide auf die Infektiosität im Kontext „pseudogetypter“ Partikel im 2-Komponenten-Kompetitionssystem untersucht. Da unter diesen Bedingungen eine Infektion über die natürlichen Rezeptoren nicht mehr möglich ist, konnte gefolgert werden, dass eine gesteigerte Transduktionseffizienz durch die Spezifität der inkorporierten Peptide vermittelt wurde. Hierbei konnte ein für glatte Muskelzellen spezifisches Peptid und ein RGD-artiges Peptid identifiziert werden, welches die Transduktionseffizienz von Ad5 gegenüber allen getesteten Zelllinien signifikant erhöhte. Somit konnte gezeigt werden, dass ein Retargeting durch Einführung Zelltyp-spezifischer Peptide möglich ist und von den natürlichen Rezeptoren unabhängige Infektionswege von adenoviralen Vektoren genutzt werden können. Im Rahmen der gewählten experimentellen Bedingungen lagen die durch die spezifischen Peptide vermittelten Transduktionseffizienzen in Abwesenheit der natürlichen Rezeptorinteraktionen in einem Bereich von 3 – 7 %. Es wäre deshalb in weiteren Experimenten zu prüfen ob eine Steigerung der Vektordosis zu einer Steigerung der Transduktionseffizienz auf ein gentherapeutisch relevanten Maß führt und die spezifischen Rezeptoren in ausreichender Menge von den Zielzellen exprimiert werden.

Translation of abstract (English)

The focus of this work was the modification of the tropism of Adenovirus Subtype 5 (Ad5) by de- and retargeting. The interactions of Ad5 with its natural receptors were analyzed in infection- and competition experiments with several permanent and primary cells in an in vitro 2-component-competition-system. By using this system it was possible to demonstrate that Ad5 uses no other primary receptors besides CAR (Coxsackievirus-Adenovirus-Receptor) and HSPG (heparansulfate proteoglycans) to infect the analyzed cells efficiently. Both uptake mechanisms show a synergistic effect during mediation of transduction. For detargeting several contact amino acids were exchanged, which play a role in CAR-interaction. The modifications were introduced in the fibers of so called pseudotyped viruses. These viruses (Ad5.GFP.DF/F+) do not possess a fibergene in their genomes but are phenotypically equipped with fiber proteins, which are provided in an established transient transfection and infection system. The data show that the double modification of amino acids S408E/P409A ablates CAR-interaction almost completely. Additional modifications of further contact residues did not enhance this effect any further. For retargeting, several peptides with a potential specificity for coronary aortic smooth muscle cells were introduced in SP-detargeted fibers and the infectivity of the pseudotyped viruses was analyzed in vitro in the 2-component-competition-system. Under these conditions infection via natural receptors is no longer possible and therefore it can be assumed, that infectivity is mediated by the incorporated ligands. The screening of retargeted Ads revealed a peptide with is specific for smooth muscle cells and an RGD-like peptide, capable to enhance infectivity in all tested cell lines. It was shown, that the introduction of celltype-specific peptides lead to retargeting mediated by receptors independend from and CAR- and HSPG. In the absence of both natural receptor interactions, the transduction efficiencies mediated by the specific peptides were between 3 – 7 % within the range of the experimental conditions. Additional experiments are required to further validate if this transduction efficiency is sufficient for therapeutical use.