English Title: melanoma antigen specific memory T cells in a transgenic mouse model of spontaneous melanoma

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Abstract

Das humane maligne Melanom spricht kaum auf gängige Therapien an was es notwendig macht, neue innovative Behandlungsstrategien zu entwickeln. Ein gutes Werkzeug hierfür ist die Verwendung von Spontanmelanom-Tiermodellen, die das humane Melanom hinsichtlich genetischer, histopathologischer und klinischer Situation kopieren. Für die vorliegende Arbeit wurde ein Spontanmelanom-Mausmodell herangezogen in dem das Ret-Transgen in Melanozyten unter der Kontrolle des Metallothionein-I Promotors überexprimiert wird (Ret-tg). Nach einer Latenzzeit von 20-150 Tagen entwickeln etwa 20% der transgenen Tiere (mit C57Bl/6 Hintergrund) Melanome in der Haut, die in Lymphknoten, Lunge und Gehirn metastasieren. Die entstandenen Tumoren exprimierten Melanom-assoziierte Antigene (MAA) wie tyrosinase related protein (TRP)-1, TRP-2 und gp100, die als Ziele für eine Immuntherapie herangezogen werden könnten. Ret-tg tumorfreie Mäuse konnten sowohl antigen-unspezifische als auch MAA-spezifische T-Zell-Antworten generieren, die in tumortragenden Tieren teilweise supprimiert waren. In der Literatur wurde gezeigt, dass im Knochenmark von Brustkrebspatientinnen Tumorantigen-spezifische central memory (CM) und effector memory (EM) T-Zellen existieren. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass CM T-Zellen im Knochenmark von melanomtragenden Ret-tg Mäusen im Vergleich zu tumorfreien Ret-tg Tieren und nicht-transgenen Kontrolltieren angereichert waren. Mit Hilfe von Tetramerfärbungen mit MHC-I Komplexen und gebundenem TRP-2 Peptid konnten in 80% der tumortragenden Ret-tg Mäusen Melanomantigen-spezifische T-Zellen im Knochenmark nachgewiesen werden. Zusätzlich konnten in 68% der untersuchten Tiere TRP-2-spezifische tumorinfiltrierende (TILs) T-Lymphozyten gefunden werden. Die Mehrheit dieser Zellen im Knochenmark und Tumor zeigten einen Gedächtnis Phänotyp. In 43% makroskopisch tumorfreier Ret-tg Mäuse, die älter als 20 Wochen waren, konnten ebenfalls TRP-2-spezifische Gedächtnis T-Zellen nachgewiesen werden. Nach einer kurzzeit-Kokultur mit dendritischen Zellen, die aus Knochenmarkvorläuferzellen aus C57Bl/6 wildtyp Tieren generiert und mit Melanomlysat beladen wurden, konnten Gedächtnis T-Zellen aus dem Knochenmark von tumorfreien und tumortragenden Ret-tg Mäuse zur Produktion von IFN- reaktiviert werden. Bereits in der latenten Phase der Melanomentwicklung existieren also funktionelle Melanom-spezifische Gedächtnis T-Zellen im Knochenmark, die dort über lange Zeit gelagert werden. Eine effektive Melanom-Immuntherapie könnte daher auf einem adaptiven Transfer in vitro restimulierter Gedächtnis T-Zellen aus dem Knochenmark von Melanompatienten, zusammen mit MAA beladenen DCs basieren.

Translation of abstract (English)

Poor response of human malignant melanoma to currently available therapeutics requires development of innovative treatment strategies based on animal models that resemble human melanoma with respect to genetics, histopathology and clinical features. For this work a recently developed mouse model of spontaneous skin melanoma was used, in which ret transgene (tg) is expressed in melanocytes under the control of metallothionein-I promoter (Ret-tg). After a short latency (1-3 months), around 19% of mice (C57Bl/6 background) develop skin melanoma metastasizing to lymph nodes, lungs and brain. In this work it was shown that tumors expressed melanoma associated antigens (MAA) tyrosinase, tyrosinase related protein (TRP)-1, TRP-2 and gp100, which could be applied as targets for the immunotherapy. Ret-tg mice without tumors could generate both antigen-unspecific and melanoma antigen-specific T-cell reactions, which were down-regulated in melanoma bearing mice. It was previously reported that the bone marrow (BM) of breast cancer patients contained tumor antigen-specific T cells with central (CM) or effector memory (EM) phenotype. Here it was shown that CM T cells were enriched in the BM of Ret-tg mice with visible skin melanoma lesions as compared to non-transgenic littermates or Ret-tg mice without tumors. Stainings with tetrameric complexes containing MHC class I H-2Kb and TRP-2 derived peptide (SVYDFFVWL) revealed that 80% of tumor bearing mice contained melanoma-specific T cells in the BM. In addition, TRP-2-specific tumor infiltrating T lymphocytes (TILs) were found in 68% of tumor bearing mice. Most of these cells in the BM or tumor showed memory phenotype. Moreover BM of 43% studied Ret-tg mice at the age of 20 weeks and older without macroscopically detectable melanoma also contained TRP-2-specific T cells predominantly with memory phenotype. After a short-term incubation with dendritic cells (DCs) generated from the BM of wild type mice and pre-pulsed with the melanoma lysate, these memory BM T cells from Ret-tg mice both with and without tumor could be reactivated to IFN--producing effector cells. This data suggest that functionally active melanoma-specific memory T cells appeared in the BM of Ret-tg mice already at the latent stage of spontaneously developing melanoma and could be maintained there at more advanced melanoma stages. Thus, effective melanoma immunotherapy could be based on the adoptive transfer of specifically restimulated BM-derived T cells together with MAA-loaded DCs.