English Title: Analysis of early steps in HIV-1-cell interaction using realtime-fuorescence microscopy

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Abstract

Der erste Schritt einer HIV-Infektion ist die Fusion des Virus mit der Plasmamembran der Zielzelle. Eine Blockade dieses Schritts, z.B. durch Medikamente, verhindert eine Neuinfektion von Zellen im menschlichen Organismus. Für die Entwicklung neuer Medikamente ist ein genaueres Verständnis der Fusionsreaktion erforderlich. Die bisherigen Analysen der Fusionskinetik beruhen nahezu ausschließlich auf biochemischen und virologischen Ensemblemessungen, die nur eine vergleichsweise geringe Zeitauflösung (im Minutenbereich) ermöglichen. Außerdem bedürfen diese Experimente einer artifiziellen Synchronisation des Ablaufs (z.B. Virusbindung an die Wirtszelle bei 4°C). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Virus-Zell-Fusionsreaktion fluoreszenzmikroskopisch in Echtzeit auf Einzelpartikelebene zu beobachten und deren Kinetik zu analysieren. Dazu wurden Viruspartikel verwendet, deren Hülle und Kern mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren markiert waren (MA.eGFP und mRFP1.Vpr). Das infektiöse, reife HI-Virus besteht aus einer Lipidhülle assoziiert mit Matrixproteinen (MA) und einem inneren Kapsid, das u.a. das virale RNA-Genom und das akzessorische Protein Vpr enthält. Bei Fusion sollte sich das Matrixprotein vom verbleibenden subviralen Partikel trennen, was als Farbtrennungsereignis im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden sollte. Darüberhinaus könnte der Transport des subviralen Partikels über mRFP1.Vpr im Zytosol weiter verfolgt werden. Basierend auf dieser Strategie sollte ein experimentelles System etabliert werden, das die Beobachtung einzelner Fusionsereignisse in Echtzeit auflöst. Die Charakterisierung der doppelt fluoreszenzmarkierten Viruspräparationen zeigte, dass die Virussuspension monodispers war und die Viruspartikel einen hydrodynamischen Durchmesser von ungefähr 170 nm besaßen. Die fluoreszenzmarkierten Viruspartikel waren zu über 90 % zweifarbig und wiesen eine um 80 % reduzierte Infektiosität im Vergleich zum Wildtyp auf. Die Fusionskompetenz war jedoch nicht beeinträchtigt. Die biochemische Analyse ergab, dass die Inkorporation von mRFP1.Vpr in die Viruspartikel die Prozessierung des Gag-Polyproteins und damit eventuell die Virusreifung leicht beeinträchtigte. Die Beobachtung der Interaktion der fluoreszenzmarkierten Viruspartikel mit der Zellmembran von adhärenten Modellzelllinien wie HeLaP4 erfolgte durch Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Als störend für die mikroskopische Analyse erwies sich eine starke Virusanheftung an den Adhäsionsfaktor Heparansulfat auf der Zelloberfläche. Es konnte gezeigt werden, dass der Beitrag von Heparansulfat auf die Infektiosität nur gering war. Daher wurde Heparansulfat in den folgenden Experimenten durch enzymatische Behandlung von der Zelloberfläche entfernt. Mehr als 10.000 Trajektorien von HIV-Partikeln, die an die Wirtszelle gebunden waren oder diese berührten, wurden manuell analysiert, aber es konnte kein Farbtrennungsereignis detektiert werden. Zur verbesserten und beschleunigten Datenauswertung wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Karl Rohr (Biomedical Computer Vision Gruppe, IPMB, Universität Heidelberg) eine Tracking-Software entwickelt. Um die Wahrscheinlichkeit der Detektion eines Fusionsereignisses zu erhöhen, wurden hochfusogene VSV-G pseudotypisierte Viruspartikel eingesetzt. Im Gegensatz zur vom HIV-Hüllprotein vermittelten Fusion an der Plasmamembran fusionieren die pseudotypisierten Viruspartikel im sauren Milieu des Endosoms. Mit den VSV-G pseudotypisierten Viruspartikeln gelang es ein Farbtrennungsereignis zu detektieren, das den Erwartungen für eine Fusion entsprach. Die Analyse des Farbtrennungsereignisses ergab, dass das Partikel nach der Farbtrennung eine gerichtete Bewegung ausführte, die auf die Interaktion des potentiell subviralen Partikels mit Motorproteinen hinweist. Obwohl nur dieses eine Farbtrennungsereignis direkt mikroskopisch nachweisbar war, konnte indirekt in den Zellen eine effiziente Fusion der VSV-G pseudotypisierten Viruspartikel gezeigt werden. Die Zellen zeigten nach Inkubation mit den Viruspartikeln im Zytosol eine diffuse Färbung hervorgerufen durch MA.eGFP, während im Zellkern eine diffuse mRFP1.Vpr-Fluoreszenz zu detektieren war. Eine mögliche Ursache für die schwierige Detektion von einzelnen Fusionsereignissen könnte die experimentell nachgewiesene Stabilisierung der Viruspartikel durch inkorporiertes mRFP1.Vpr sein, die eine Trennung von Matrix und Viruskapsid beeinträchtigte. In dieser Arbeit wurden die technischen Grundlagen für eine effiziente Detektion von Virus-Zell-Interaktionen durch Etablierung der Mikroskopie- und Auswertetechnik geschaffen. Die hierfür entwickelte Tracking-Software erlaubt eine schnelle und quantitative Auswertung großer Experimentreihen. Die dazu notwendigen zweifarbig fluoreszenzmarkierten Viruspartikel wurden ausführlich charakterisiert, so dass zukünftig die Fusion auf Einzelpartikelebene mit verbesserten Systemen effizienter untersucht werden kann.

Translation of abstract (English)

The initial step of a human immunodeficiency virus (HIV) infection is the fusion of the virus with the plasma membrane of the host cell. The infection of new cells is abrogated if this step is blocked. Extending the knowledge of the fusion reaction is essential for the development of new drugs. The current information about fusion kinetics relies mainly on biochemical and virological bulk measurements. These assays only allow a low temporal resolution (in the minute scale). Additionally, these experiments need to be artificially synchronized (e.g. by prebinding of the virus at 4°C). The aim of this work was to study the virus-cell-fusion on the single particle level in real time using fluorescence microscopy techniques. Therefore a double labelling strategy was developed. One label was attached to the viral membrane (MA.eGFP) and the other was located in the viral core structure (mRFP1.Vpr). The infectious, mature HI-Virion consists of a lipid membrane and an attached matrix (MA) layer and an inner Capsid structure bearing e.g. the RNA genome and the accessory protein Vpr. These to markers should separate at the time of viral fusion and the fusion should therefore be detectable as a colour separation event using fluorescence microscopy. The tracking of the subviral particle only labelled with mRFP1.Vpr should allow to get new insights into its intracellular transport. Based on this strategy, an experimental system should be established allowing the detection of single virus fusion events with the host cell. The characterization of the virus preparations showed that the virus suspension consisted of a single species with a hydrodynamic diameter of approx. 170 nm. More than 90% of the particles were double labelled and the infectivity was reduced by 80%. The fusion competence was equal to the wildtype. Biochemical analysis revealed that the incorporation of mRFP1.Vpr into the viral particle reduced the cleavage of the Gag-polyprotein and therefore might interfere slightly with particle maturation. The virus-cell-interaction at the plasma membrane of adherent model cell lines like HeLaP4 was studied by real time fluorescence microscopy. The binding of many virus particles at the plasma membrane mediated by the adhesion factor heparan sulfate complicated the microscopic analysis. Since it could be shown that this immobilization was not essential for productive infection, heparan sulfate on the cell surface was removed by enzymatic treatment in the following experiments. More than 10,000 trajectories of HIV-particles touching the cell or bound to the host cell were manually analyzed, but no event of colour separation was observed. In order to improve the accuracy and speed of data analysis, a tracking software was developed in collaboration with the group of Prof. Dr. Karl Rohr (Biomedical Computer Vision Group, IPMB, Abteilung Bioinformatik & Funktionelle Genomik, Universität Heidelberg). To increase the probability of viral fusion, highly fusogenic VSV-G pseudotyped viral particles were used. In contrast to the HIV envelope protein mediated fusion at the plasma membrane these pseudotyped particles fuse in the acidified endosome. One colour separation event fulfilling the expected criteria for membrane fusion could be detected and analyzed. The directed movement of the potential subviral particle after colour separation indicated the involvement of motor proteins. Although only one colour separation event could be directly observed, an efficient fusion could be microscopically proven by the detection of a fusion dependent diffuse staining of the cytoplasm in the colour of the MA-label. At the same time, the nucleus was coloured diffusely by the Vpr-label. The possible cause for the difficulties observing single fusion events might be the experimentally detected stabilization of the virus particle by incorporated labelled Vpr, impairing the separation of the MA-layer and the viral core at the time point of fusion. In this thesis an experimental system for the analysis of HIV-cell interaction dynamics was established and characterized and the technical requirements for data acquisition and analysis were implemented. Problems generated by the labelling strategy were investigates and alternative strategies evaluated. This lays the foundation to investigate the viral fusion reaction on the single particle level with a more efficient system in the future.