English Title: Functional Analyisis of Livin: Interaction with the "Amino-terminal Enhancer of Split" (AES)-Protein

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Abstract

Das anti-apoptotische Livin-Protein ist ein Mitglied der "Inhibitor of Apoptosis Protein" (IAP)-Proteinfamilie. Es wird vornehmlich in Tumoren exprimiert und trägt zu deren Resistenz gegenüber Chemotherapeutika bei. Über die molekularen Wirkmechanismen von Livin ist noch wenig bekannt. Übergeordnetes Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, neue Einblicke in die intrazellulären Aktivitäten des Livin-Proteins zu bekommen. Mit dem "Yeast-2-Hybrid"-Verfahren wurde nach neuen Interaktionspartnern von Livin gesucht. Zu den potenziellen Bindungspartnern, die dabei identifiziert wurden, gehörte das "Amino-terminal Enhancer of Split" (AES)-Protein, ein Mitglied der Gro/TLE-Familie. Da AES an der Apoptose-Regulation und an der Transkriptionskontrolle beteiligt ist, konzentrierten sich die weiteren Analysen auf die Livin-AES-Interaktion. Bindungsanalysen in Hefe- und Säugerzellen ergaben, dass die Interaktion hochspezifisch ist. So bindet AES nicht an andere IAP-Proteine, während Livin nicht mit dem AES-verwandten TLE2-Protein interagiert. Die Livin-AES-Interaktion wurde durch in vitro-Experimente bestätigt. Die für die Interaktion kritischen Domänen wurden mittels Mutationsanalysen auf die BIR-Domäne von Livin und die Q-Domäne von AES eingeengt. Mit gerichteten Mutationen wurde in der AES-Q-Domäne eine Aminosäure kartiert, deren Transfer in die homologe Q-Domäne des TLE2-Proteins ausreichte, die Bindungsfähigkeit an Livin auf TLE2 zu übertragen. Funktionelle Analysen ergaben, dass AES pro-apoptotisch wirkt, insbesondere in Kombination mit genotoxischen Agenzien. Dies könnte mechanistisch darauf beruhen, dass AES in der Lage ist mit der Interaktion zwischen Livin und Smac zu interferieren. Freigesetztes Smac wäre dann in der Lage, die Hemmfunktion anderer IAPs auf Caspasen zu neutralisieren und letztendlich Apoptose zu induzieren. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Livin die transkriptionelle Aktivität von AES modulieren kann. So steigert die Koexpression von Livin und AES die Aktivität eines TCF-abhängigen Zielpromotors. TCF-Faktoren spielen eine wesentliche Rolle für die Stimulation der Zellproliferation im Rahmen der Wnt-Signalkaskade. Diese Befunde verbinden, mit AES als Schalter, erstmals IAP-Proteine mit der Wnt-Signalkaskade. Zukünftig wird es interessant sein, diese Verknüpfung in Tumoren weiter aufzuklären, da sich Tumorzellen typischerweise durch konzertierte Störungen von Apoptose- und Proliferationskontrolle auszeichnen.

Translation of abstract (English)

The anti-apoptotic Livin protein is a member of the “Inhibitor of Apoptosis Protein” (IAP) family. Livin is preferentially expressed in tumors and contributes to their apoptotic resistance towards chemotherapy. Little is known about the molecular activities of Livin. It was the overall aim of the study, to gain new insights into the intracellular activities of Livin. To search for novel interaction partners for Livin, the yeast two-hybrid system was employed. Several potential binding partners were identified, among them the “Amino-terminal Enhancer of Split” (AES) protein, a member of the Gro/TLE protein family. Since AES is believed to participate in apoptosis regulation and in transcriptional control, subsequent analyses focused on the Livin-AES interaction. Binding analyses in yeast and mammalian cells indicated that the interaction is highly specific: AES did not bind to other IAP proteins, whereas Livin did not interact with TLE2, a TLE protein which is closely related to AES. The interaction between Livin and AES was also verified by in vitro binding studies. The critical domains for the Livin-AES interaction were mapped by mutational analyses to the BIR domain of Livin and to the Q domain of AES. Site directed mutagenesis identified a critical amino acid residue within the AES Q domain. The introduction of this amino acid into the Q domain of TLE2 conferred the ability to interact with Livin to the TLE2 protein. Functional analyses revealed that AES exerts pro-apoptotic activities, in particular in combination with genotoxic agents. Mechanistically, this could be related to the observation in this study that AES is able to interfere with the Livin-Smac interaction. Upon release from Livin, Smac may be able to neutralize the inhibition of caspases by other IAPs, eventually resulting in apoptosis induction. Furthermore, it was found that Livin has the potential to modulate AES-dependent transcriptional regulation. Co-expression of Livin and AES stimulated the activity of a promoter targeted by TCF factors. These transcription factors play a crucial role for the induction of cell proliferation in the context of the Wnt signaling cascade. These findings indicate that AES may bridge IAP proteins with Wnt signaling. It will be interesting for future analyses, to further analyze this connection in tumor cells which are typically characterized by concerted deregulations of apoptosis and proliferation control.