English Title: Interactions of SNAREs in the early secretory system of plant cells

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Abstract

Eine essentielle Funktion aller eukaryotischen Zellen ist die Kontrolle des Transports von Prote-inen und Lipiden innerhalb des Endomembransystems. Die Fusion von Membranen ist eine fundamentale biochemische Reaktion und ein wichtiger Schritt aller vesikulären Transportvor-gänge, insbesondere des sekretorischen und des endocytotischen Wegs. Die wesentlichen Schritte des Vesikel-vermittelten Transports sind die Formation von Vesikeln des Donor-Kompartiments, die Translokation und das „Tethering“ dieser Vesikel zu einem Zielkomparti-ment und letztendlich das Andocken und die Fusion der Vesikel mit dem Zielkompartiment. Das gegenwärtige Modell der Spezifität der Vesikelfusion besagt, dass diese auf entsprechenden SNARE-Proteinen mit einer genau definierten subzellulären Lokalisation beruht (Söllner et al., 1993; Rothman and Warren, 1994). Seit der ersten Arbeit zu SNARE-Proteinen aus Säugerzel-len (Block et al., 1988) gelang es verschiedenen Arbeitsgruppen weitere strukturelle Bestandtei-le der SNARE-Komplexe in Hefe und Säugern zu identifizieren und die SNARE-vermittelte Fusion auch funktionell zu charakterisieren (Bennet and Scheller, 1993; Burri and Lithgow, 2004; Hong, 2005; Jahn and Scheller, 2006). Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Charakterisierung und Lokalisierung der SNARE-Proteine LeBet1, LeBos1, Le-Sec22 und LeSed5 in Nicotiana tabacum durch in vivo Experimente. Zur Charakterisierung der jeweiligen SNARE-Proteine wurde eine Methode verwendet mit der eine Veränderung der Transportvorgänge im frühen sekretorischen Weg visualisiert werden konnte. Hierbei wurde der Einfluss der verschiedenen SNARE-Proteine auf die Sekretion eines löslichen Reporterproteins (a-Amylase) in Tabak-Protoplasten untersucht und quantifiziert. Die Überproduktion der beiden SNARE-Proteine LeBet1 und LeSec22 in ihrer Wildtypform und auch als Transmembrandomäne-Deletionsmutanten zeigte keinen Einfluss auf die Sekretion von a-Amylase. Anhand von Lokalisierungsstudien konnte LeBet1 am Golgi-Apparat und Le-Sec22 sowohl am Golgi-Apparat als auch am ER lokalisiert werden. Die Überproduktion von LeBos1 zeigte einen inhibitorischen Effekt auf die a-Amylase-Sekretion, wohingegen die Transmembrandomäne-Deletionsmutante keinen Einfluss darauf hatte. Bei Koexpressionsstudien mit Fluoreszenzfusionsproteinen in Tabak-Protoplasten oder BY-2 Zellen kam es jeweils zu einer Umverteilung des Golgi-Markers ManI-RFP in das ER. Nach Behandlung mit BFA lösten sich die punktartigen Strukturen von YFP-LeBos1 auf und die Fluoreszenz konnte im ER detektiert werden; woraus hervorgeht, dass LeBos1 im Golgi-Apparat lokalsiert ist. Zur funktionellen Charakterisierung des SNARE-Proteins LeSed5 wurde dessen Einfluss auf die Sekretionsrate der a-Amylase sowohl mit den jeweiligen Wildtyp-Proteinen als auch mit den dNT-, dTMD- und dNTdTMD-Mutanten untersucht. Die Wichtigkeit der Transmembran-domäne zeigte sich durch den fehlenden inhibitorischen Effekt der dTMD- und dNTdTMD-Mutanten, wie er sonst bei der Überexpression von LeSed5-Wildtyp und dessen dNT-Mutante auftrat. LeSed5 beeinträchtigt sowohl anterograden als retrograden Transport zwischen ER und Golgi-Apparat, was nicht auch zuletzt durch den inhibitorischen Effekt auf den Reporter a-Amylase-HDEL gezeigt werden konnte. Die Daten aus den Ergebnissen ließen den Schluss zu, dass der inhibitorische Effekt zeitabhängig ist. Dabei setzte zunächst die Inhibierung der Sekre-tion sofort ein, während die Toxizität des Proteins LeSed5 an sich aber erst nach vier Stunden wirksam wurde. CLSM-Studien von LeSed5 zusammen mit Marker Proteinen, die über COPII-Vesikel transportiert werden zeigten, dass deren korrekte Lokalierung nicht mehr gewährleistet wurde und diese hauptsächlich im ER zurückblieben. Der Transport der vakuolären Proteine wurde bei Koexpression mit LeSed5 hingegen nicht beeinflusst. Der inhibitorische Effekt von LeSed5 auf den ER-Golgi-Transport wurde bei Fusion eines XFP-Proteins an den C-terminus des SNAREs aufgehoben, während er bei der Fusion an den N-Terminus erhalten blieb. Das nicht funktionelle C-terminale und auch das funktionelle N-terminale Fusionsprotein konnten am Golgi-Apparat lokalsiert werden, was auch durch BFA-Studien belegt wurde. Die Expressi-on des funktionellen Fusionsproteins führte zu einer vermehrten Aggregatbildung; diese Aggre-gate erwiesen sich als BFA-resistent. Was diese Aggregate im Endeffekt wirklich darstellen konnte durch die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Floreszenzstudien nicht beantwortet werden. Die Ergebnisse der Arbeit weisen jedoch darauf hin, dass das SNARE-Protein LeSed5 einen wichtigen regulatorischen Faktor in der Fusionsmaschinerie des ER-Golgi-Transports darstellt.

Translation of abstract (English)

An essential function of all eukaryotic cells is the control of protein and lipid trafficking within the endomembrane system. Membrane fusion is a fundamental biochemical reaction and an important step in vesicular trafficking routes of the secretory pathway and endocytosis. The basic steps of vesicle mediated transport are the formation of vesicles at the donor compartment, translocation and tethering of the vesicles to their target compartment and finally docking and fusion of vesicles with their target compartment. The current model of specificity of vesicle fusion signifies that fusion is based on an appropriate set of SNAREs with a defined subcellular localisation (Söllner et al., 1993; Rothman and Warren, 1994). Since the first study about SNAREs in mammalian cells (Block et al., 1988) different groups have been able to identify the structural properties of the SNARE complex in yeast and mammals (Bennet and Scheller, 1993; Burri and Lithgow, 2004; Hong, 2005; Jahn and Scheller, 2006). Because of the high number of SNAREs in plants the understanding of SNARE function in plants is far behind. The main focus of the present dissertation was the functional characterisation and localisation of the SNARE proteins LeBet1, LeBos1, LeSec22 and LeSed5 in Nictiana tabacum by in vivo approaches. In order to do so a method was used which allows for a quantitative analysis of the trafficking in the early secretory pathway in vivo. Thus, the effect of distinct SNAREs on the secretion of a soluble reporter protein (a-amylase) can be quantified. Overproduction of both, LeBet1 and LeSec22 as wild type proteins or transmembrane deletion mutants did not show any effect on a-amylase secretion. Localisation studies demonstrated that LeBet1 is localised to the Golgi stacks whereas LeSec22 is localised to both, ER and Golgi stacks. Overproduction of LeBos1 by contrast leads to an inhibition of a-amylase secretion, whereas the transmembrane deletion mutant did not show any effect. In studies coexpressing XFP-tagged proteins in tobacco protoplasts or BY-2 cells the Golgi-marker ManI-RFP is mislocalised to the ER. In BFA-treated protoplasts expressing YFP-LeBos1 the punctate pattern of the YFP-signal disappeared and the signal is detected in the ER suggesting that LeBos1 is localised to the ER. For functional characterisation of the SNARE protein LeSed5, an effect of wild type protein and its dNT-, dTMD- and dNTdTMD-deletion mutants on the secretion of a-amylase has been investigated, which was detected by overexpression of LeSed5 wild type and its dNT-mutant. An important role of the transmembrane domain in the sorting has been ruled out by the absence of an inhibitory effect of dTMD- and dNTdTMD-mutants on a-amylase secretion. LeSed5 does not only inhibit the secretion of a-amylase but also influences trafficking of a-amylase-HDEL, suggesting that both, anterograde and retrograde trafficking between the ER and the Golgi are affected by overexpression of LeSed5. Although overproduction of LeSed5 is cytotoxic, I believe that the effect on the secretory pathway is specific for the following reason: The block in secretion occurs immediately after infection, the decrease of protein synthesis is detectable only after 4 hours. CLSM studies of LeSed5 together with marker proteins that are transported from the ER to the Golgi in a COPII-dependent manner showed, that these markers were mislocalised to the ER. However, trafficking of vacuolar proteins was not influenced by coexpression of LeSed5. The inhibitory effect of LeSed5 on the ER-Golgi trafficking was dependent on the fusion site of the fluorescent protein (XFP): whereas the N-teminal XFP-Fusion was activ, the C-terminal XFP-Fusion was inactive. Nevertheless, both C- and N-terminal XFP-tagged LeSed5 were localised to the Golgi stacks, as also documented by the effects of BFA-treatment. But expression of the functional N-terminal tagged LeSed5 caused an increased formation of aggregates, which show BFA resistance. The structure of these aggregates could not be explained in this study. These results indicate that the SNARE protein LeSed5 is a crucial regulatory factor in the fusion machinery of ER-Golgi trafficking.