German Title: Zielgerichteter Transport zur Anreicherung des HIV-1 Proteins p24 zu Kompartimenten des Endomembransystems in Tabakpflanzen

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Abstract

Molecular farming aims at producing high-value proteins in plants for pharmaceutical or other industrial use. Tobacco is one of the most used systems in this field of research, offering developed technology for gene transfer and protein expression. Foreign protein stability is a major issue in molecular farming and is strongly dependent on the subcellular compartment of accumulation. We are screening various compartments of the plant endomembrane system for the high accumulation of the HIV-1 p24 nucleocapsid protein, a potential vaccine against the human immunodeficiency virus. Previous work has shown that the localisation of fusions of GFP (Green Fluorescent Protein) to the full length or truncated versions of the transmembrane domain (TMD) of human LAMP1 (Luminal Associated Membrane Protein 1) in tobacco, was detected in the lumen of different compartments of the plant secretory pathway (endoplasmic reticulum -ER-, Golgi Apparatus or plasma membrane), depending on the length of the TMD. In this work, different p24 fusion proteins were designed to accumulate in different compartments of the secretory pathway in tobacco cells. Therefore, the HIV-1 p24 was fused at the N- or C-terminus of the Red Fluorescent Protein (RFP) followed by the different TMDs. Moreover, p24 was also N- or C-terminally fused to the N-terminal domain of maize prolamin γ-zein (zein-p24 and p24-zein). Zein proteins are originally accumulated in ER-derived protein bodies in seeds and previous studies showed the potential of accumulating heterologous proteins in this compartment protecting them from proteases and enhancing their stability. Finally, p24 was fused to the C-terminal tail-anchor of cytochrome b5 (p24-TA), which is expected to be anchored in the ER membrane facing the cytosol. Localisation studies in tobacco protoplasts showed that the constructs containing RFP at the C-terminus of the p24 (p24RFP-TMD) are targeted to the expected compartments (ER, Golgi Apparatus or plasma membrane). However, when the RFP is placed at the N-terminus of p24 (RFPp24-TMD) the fluorescence appears in the tonoplast and the vacuolar lumen, indicating vacuolar delivery and cleavage from the membrane anchor. Transgenic tobacco plants expressing the p24RFP-TMD fusion proteins with the correct targeting to the ER, Golgi and plasma membrane, and also expressing zein-p24, p24-zein and p24-TA were produced. The highest accumulation levels (1% of total soluble protein, TSP) were achieved for p24 containing zein in either N-terminal or Cterminal position. Fusion proteins targeted to the ER showed different accumulation levels if the protein was exposed on the luminal side (p24RFP-TMD, 0.3% TSP) or in the cytosolic side (p24-TA, 0.15% TSP). p24RFP-TMD fusion proteins accumulating in the Golgi apparatus and the plasma membrane showed accumulation levels around 0.15% TSP. The zein fusions formed polymers that were in part difficult to denature even in the presence of SDS, a feature that suggests protein body formation. Pulse-chase experiments indicated that the difference in accumulation of the constructs was mainly due to difference in protein stability. However, RNA blot analysis showed that the zein fusions also lead to increased RNA accumulation. In all cases, the p24 could be released from the fusion tags by digestion with thrombin as the p24 fusion proteins were designed to have a thrombin cleavage site for purification purposes. On the whole, these results highlight the promising approach of targeting HIV-1 p24 to the ER by fusing to the zein domain and provide new information on the relationship between subcellular localisation and stability of integral membrane proteins.

Translation of abstract (German)

Das Ziel des “Molecular Farmings” ist es hoch qualitative Proteine für den pharmazeutischen oder weiteren industriellen Gebrauch in Pflanzen zu produzieren. Die meist verwendete Modellpflanze für das “Molecular Farming” stellt Tabak dar, da für diesen Organismus die molekularen Techniken zum Gentransfer bzw. für Proteinexpression optimiert wurden. Ein Problem des “Molecular Farmings” stellt die Stabilität exprimierter Fremdproteine je nach subzellulärer Lokalisation dar. Diese Arbeit untersucht die Auswirkung der Expression des Nukleokapsid-Proteins p24 aus HIV-1 (“Human Immunodeficiency Virus”) in den verschiedenen Kompartimenten des Endomembransystems der Pflanze. Dabei handelt es sich um einen möglichen Impfstoff gegen das HIV. Mittels der Fusion des Fluorophores GFP an die Transmembrandomäne (TMD) des humanen Proteins LAMP1 (“Luminal Associated Membrane Protein 1”) bzw. an Deletionskonstrukte dieser LAMP1-TMDs konnte bereits gezeigt werden, dass deren Lokalisation innerhalb der verschiedenen Kompartimente des sekretorischen Systems der Tabak-Pflanze (Endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat oder Plasmamembran) abhängig ist von der Länge der jeweiligen Transmembrandomäne. Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Fusionsproteine hergestellt um die Expression des p24 in verschiedenen Kompartimenten der Pflanzenzelle in Tabak zu untersuchen. Zunächst wurde an das Protein p24 aus HIV-1 C- oder N-terminal ein RFP (“Red Fluorescent Protein”) fusioniert. Anschließend wurden an den C-Terminus dieses Fusionsproteins die verschiedenen TMDs fusioniert. Des Weiteren wurde p24 N- oder C-terminal mit der N-terminalen Domäne von Prolamin γ-Zein aus Mais fusioniert (Zein-p24 oder p24-Zein). Das Prolamin γ-Zein reichert sich Ursprünglicherweise in ER-gereiften Proteinkörpern (“protein bodies”) im Samen an. Vorhergehende Studien zeigten, dass in diesen Proteinkörpern akkumulierte heterologe Proteine vor Proteasen geschützt sind und dadurch deren Stabilität gefördert wird. Für ein weiteres Fusionsprotein wurde p24 an die endständige Transmembrandomäne von Cytochrom b5 fusioniert (p24-TA). Dadurch wird gewährleistet, dass das rekombinante Protein in der Membran des ERs verankert wird, wobei das p24 sich im Cytosol befindet. Anhand von Lokalisierungsstudien in Tabak-Protoplasten konnte festgestellt werden, dass die p24-Fusionsproteine, welche das RFP am C-Terminus tragen (p24RFP-TMD), im jeweils erwarteten Zielkompartiment lokalisiert waren (ER, Golgi-Apparat oder Plasmamembran). Jedoch wurden die p24-Fusionsproteine, die das RFP am N-Terminus tragen (RFPp24-TMD) am Tonoplasten und in der Vakuole detektiert. Diese Mislokalisierung in die Vakuole ist wahrscheinlich auf eine Abspaltung der Transmembrandomäne zurückzuführen. Es wurden transgene Tabakpflanzen erstellt, die die Fusionsproteine p24RFP-TMD mit Lokalisationssignalen für entweder ER, Golgi-Apparat oder Plasmamembran enthielten. Darüber hinaus wurden auch Pflanzen hergestellt, welche die Proteine Zeinp24, p24-Zein und p24-TA enthielten. Die höchste Ansammlung (1% total soluble protein, TSP) wurde bei den N- bzw. C-terminal Zein-fusionierten p24 Pflanzen erreicht. Fusionsproteine mit einem ER-Signal zeigten ein unterschiedliches Akkumulationsniveau, je nachdem, ob p24 luminal (p24RFP-TMD, 0.3% vom TSP), oder cytosolisch (p24-TA, 0.15% vom TSP) exponiert wurde. Das Akkumulationsniveau von p24RFP-TMD im Golgi-Apparat und in der Plasmamembran betrug 0.15% der TSP. Die Zein-Fusionsproteine formten Polymere, die teilweise schwer zu denaturieren waren, selbst unter Verwendung von SDS. Dieses Verhalten lässt den Schluss zu, dass die Zein-Fusionsproteine zu Proteinkörpern fusionieren und damit sehr stabil sind. Das unterschiedliche Akkumulationsniveau dieser Konstrukte konnte durch Pulse-chase Experimente auf eine unterschiedliche Proteinstabilität zurückgeführt werden. RNA-blot-Analysen zeigten jedoch, dass diese Zein-Fusionen ebenfalls zu einer erhöhten RNA-Anreicherung führten. Bei allen Experimenten konnte aufgrund eingefügter Thrombin-Schnittstellen zwischen p24 und der daran fusionierten Sequenzen das virale Protein p24 aus dem jeweiligen Fusionsprotein mittels eines Thrombinverdaus gelöst werden. Zusammenfassend ergaben die Ergebnisse dieser Arbeit einen viel versprechenden Ansatz, wie das Protein p24 zielgerichtet durch Fusionen an die Zein-Domäne zum ER transportiert werden kann. Darüber hinaus wurden neue Informationen über das Verhältnis zwischen subzellulärer Lokalisation und Stabilität von Membranproteinen präsentiert.