German Title: Einfluss der Papillomavirus Early Proteine auf die Expression tumorprogressionsfördernder Gene

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Abstract

Human papillomaviruses (HPV) are the known cause for cancers of the cervix and are associated with a variety of other human malignancies including head and neck, and skin. The cottontail-rabbit papillomavirus (CRPV) serves as a suitable animal model to study the development and progression of these cancers in-vivo. Our group has previously demonstrated that CRPV-induced skin lesions express elevated levels of metalloproteinase-9, a protease contributing to cancer progression by extracellular matrix remodelling. Based on our previous findings that the CRPV early protein 2 (E2) can activate a truncated human MMP-9 promoter fragment, we hypothesized that enhanced MMP-9 expression in the rabbit lesions is a consequence of activation of the rabbit MMP-9 promoter by CRPV E2. In order to elucidate the mechanism involved in MMP-9 promoter activation a library of genomic DNA isolated from rabbit skin was constructed, and the sequence of the MMP-9 promoter was identified. Promoter deletion mutants were cloned and the minimum required fragment for E2-mediated MMP-9 promoter activation was determined to be -717 bp in length. Selective mutation of transcription factor binding sites within the promoter sequence revealed a high importance of both of the two identified AP-1 binding sites in the rabbit MMP-9 promoter. Using the transactivation-deficient c-Jun mutant TAM67, a strong inhibitory effect on promoter activation after challenge with E2 could be observed, suggesting an important role of c-Jun in the activating AP-1 transcription-factor complex. The same mechanism could be shown in the human system during this study. Furthermore, it could be determined that in both, the rabbit and the human system, the activation of the MMP-9 promoter by E2 requires the phosphorylation of the MAP-kinase ERK, as inhibition of the cascade by the chemical inhibitor PD098059 resulted in a significant decrease of promoter activation. Co-transfection of E2 and siRNA directed against ERK or a dominant-negative mutant of the latter led to similar results. It has been described previously that the high-risk HPV E2 is located within both nucleus and cytoplasm. Mutations in the domains responsible for protein localization allowed for investigation of the role of E2 localization in the activation of the MMP-9 promoter. It was observed that MMP-9 activation was strikingly decreased when the protein was mainly cytoplasmic. Additionally, HPV6bE2 which has been described to be solely nuclear did also induce MMP-9 promoter activation. It can hence be concluded that CRPV E2 and HPV16 E2 both activate the respective MMP-9 promoters via an AP-1 and ERK dependent mechanism. As direct binding of the E2 proteins to the promoter can be roled out, this mechanism has to be further investigated. It can, however, be hypothezised that the interaction of E2 with its potential interation partner is taking place within the nucleus.

Translation of abstract (German)

Infektionen mit humanen Papillomviren sind ursächlich für die Entstehung des Zervixkarzinoms und werden mit weiteren malignen Tumorerkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht. Das einzige verfügbare Tiermodell zum Studium der Papillomavirus-assoziierten Tumorentstehung ist das Cottontail rabbit Papillomvirus (CRPV) Modell. Nach subkutaner Applikation der viralen DNA in Kaninchen kommt es zur Ausbildung von Papillomen, welche sich ohne Kofaktoren zu infiltrierenden Tumoren entwickeln. In vorausgehenden Studien unserer Gruppe konnte gezeigt werden, dass die CRPV-induzierten Hautläsionen des Kaninchens eine erhöhte Expression der Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) aufwiesen. Dieser Protease wird eine wichtige Rolle in der Tumorigenese zugeschrieben, da sie an der Umstrukturierung und dem Abbau der extrazellulären Matrix beteiligt ist. Aufgrund der früheren Studien bei denen gezeigt wurde, dass das E2 Protein von CRPV in der Lage ist, eine verkürzte Form des humanen MMP-9 Promotors zu aktivieren, entstand die Vermutung, dass die gesteigerte Expression von MMP-9 in den CRPV-induzierten Hautläsionen eine Folge der Aktivierung des Kaninchen-MMP-9 Promotors ist. Um den zugrundeliegenden Mechanismus zu untersuchen, wurde zunächst eine DNA-Bibliothek mit genomischer DNA aus Kaninchenhaut erstellt und die Sequenz des Kaninchen-MMP-9 Promoters ermittelt. Promoter-Deletionsmutanten wurden kloniert und wir konnten nachweisen, dass 717 bp des Promoters ausreichend für die E2 induzierte Aktivierung sind. Selektive Mutationen von Transkriptionsfaktor-Bindestellen ergaben, dass beide im Kanichenpromoter identifizierten AP-1 Bindestellen von grosser Bedeutung für die Aktivierung sind. Auch Kotransfektion der transaktivierungsdefizienten c-Jun Mutante TAM67 zeigte eine deutliche Hemmung der E2 gesteuerten Promotoraktivierung, was auf eine bedeutende Rolle dieses fakultativen Bestandteils des AP-1 Komplexes hindeutet. Dieser Mechanismus konnte in dieser Arbeit auch im humanen System unter Zuhilfename des humanen Papillomavirus 16 (HPV16) aufgezeigt werden. Des Weiteren konnte die Abhängigkeit der Induktion des MMP-9 Promotors von einer Aktivierung der MAP-Kinase ERK sowohl im Kaninchen als auch im humanen System demonstriert werden. Die Inhibition der ERK-Kaskade durch den niedermolekularen Inhibitor PD098059, wie auch durch Kotransfektion von ERK siRNA oder dominant-negativen ERK Mutanten, mündete in einem Rückgang der E2-vermittelten Promotoraktivität. Es wurde zuvor beschrieben, dass das E2 Protein von Hochrisiko HPV-Typen im Nukleus sowie im Zytoplasma der infizierten Zelle zu finden ist. Mutationen in den Domänen des E2, die für die Proteinlokalisation verantwortlich sind, boten die Möglichkeit, die Rolle der Lokalisation von E2 in der Aktivierung des MMP-9 Promotors zu klären. Mutiertes E2, welches überwiegend im Zytoplasma der Zellen nachweisbar war, zeigte ein wesentlich geringeres Potential zur MMP-9 Promoteraktivierung. Zudem konnte gezeigt werden, dass HPV6b E2, welches ausschliesslich nukleär vorliegt, ebenfalls in der Lage ist den MMP-9 Promotor zu aktivieren. Die hier vorliegenden Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass sowohl CRPV E2 als auch HPV16 E2 die respektiven MMP-9 Promotoren über einen AP-1 und ERK-abhängigen Mechanismus aktivieren. Da ausgeschlossen werden kann, dass die Proteine direkt den jeweiligen Promotor binden, bedarf der genaue Mechanismus weiterer Aufklärung. Es kann jedoch postuliert werden, dass eine Wechselwirkung von E2 mit einem potentiellen Interaktionspartner im Nukleus stattfindet.