English Title: Functional and molecular characterization of Far9, a novel mitotic regulator

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Abstract

Am Ende der Anaphase, nach abgeschlossener DNA-Segregation, findet der Übergang in die G1-Phase statt. Für diesen Übergang ist die Inaktivierung der Cdk-Aktivität von entscheidender Bedeutung. In S. cerevisiae ist die konservierte Phosphatase Cdc14 verantwortlich für die Inaktivierung der Cdk-Aktivität. Den größten Teil des Zellzyklus liegt Cdc14 inaktiv im Nukleolus vor. Erst zum Beginn der Anaphase wird Cdc14 aus dem Nukleolus freigesetzt, was mit ihrer Aktivierung einhergeht. Die Freisetzung von Cdc14 wird von zwei Regulationsmechanismen gesteuert: Dem FEAR (Cdcfourteen early anaphase release)-Netzwerk und dem MEN (mitotic exit network). Das FEAR-Netzwerk besteht aus den Komponenten Esp1, Slk19, Spo12, Bns1 sowie der Kinase Cdc5 aus der Polo-Familie und ist für die Freisetzung von Cdc14 in der frühen Anaphase verantwortlich. Dabei ist die funktionale Beziehung der einzelnen Komponenten bisher nicht aufgeklärt. Die Funktion von Cdc14 zu diesem Zeitpunkt des Zellzyklus liegt in der Regulation der Stabilität des mitotischen Spindelapparates, der Positionierung des sich teilenden Kerns, der Segregation von repetitiver DNA (rDNA) sowie der Aktivierung des MEN. Durch das FEAR-Netzwerk freigesetztes Cdc14 ermöglicht allerdings nicht die vollständige Inaktivierung der Cdk-Aktivität, die für den Übergang von der Anaphase in die Cytokinese essentiell ist. Dafür ist am Ende der Anaphase die Aktivität des MEN erforderlich. Das MEN führt zu einer vollständigen Cdc14-Aktivierung und damit zur Inhibierung der Cdk-Aktivität. Dabei handelt es sich beim MEN um eine GTPase-gesteuerte Kinasekaskade, die mit dem Spindelpolkörper (SPB, entspricht dem Centrosom von Säugerzellen) assoziiert ist. Das MEN bestehend aus der GTPase Tem1, die durch den GEF Lte1 aktiviert und dem GAP-Komplex aus Bfa1 und Bub2 inaktiviert wird sowie der darunter liegenden Kinasekaskade aus Cdc15 und Dbf2/Mob1. Auch hier sind wie im FEAR-Netzwerk einige Schritte ungeklärt. Unter anderem ist der GEF für Tem1, Lte1, bei Temperaturen über 23 °C nicht essentiell. Dies deutet auf weitere Aktivatoren des MEN hin. In einem genetischen Screen wurde FAR9 als Promotor des Übergangs von der Mitose in die G1-Phase identifiziert. Epistatische und funktionelle Analysen konnten Far9 des Weiteren als Aktivator des MEN spezifizieren. Als biochemisches Bindemodul verfügt Far9 über eine FHA-Domäne. Diese Bindedomäne assoziiert mit Phosphoproteinen und ist essentiell für die Funktion von Far9 als MEN-Aktivator. Schließlich konnte der GAP-Komplex aus Bfa1-Bub2 als regulatorischer Bindungspartner von Far9 identifiziert werden, über den Far9 als positiver MEN-Regulator agieren könnte.

Translation of abstract (English)

In anaphase, after the full elongation of the mitotic spindle and separation of the sister chromatids, cyclin-dependent kinase (Cdk) activity must be downregulated to allow the transition out of mitosis (mitotic exit) and cytokinesis to occur. In budding yeast, the conserved phosphatase Cdc14 plays a major role in Cdk inactivation. Until anaphase, Cdc14 is sequestered in an inhibitory complex located in the nucleolus. The release of Cdc14 from the nucleolus activates Cdc14 and is regulated by two networks. The FEAR (Cdcfourteen early anaphase release) network functions early in anaphase and is responsible for the activation of only a certain pool of Cdc14. Components of the FEAR network are Separase (Esp1 in budding yeast), the kinetochore and spindle protein Slk19, Spo12 and its homolog Bns1 as well as the polo kinase Cdc5. The relationship and the molecular regulation of the FEAR components are not known so far. Cdc14 released via this pathway regulates several processes, including chromosome segregation and microtubule stability, however it is not sufficient to trigger Cdk inactivation and subsequent mitotic exit. For the later processes to occur, activation of the mitotic exit network (MEN) is essential. The MEN is a GTPase driven signaling transduction cascade associated with the yeast centrosome, named the spindle pole body (SPB). The most upstream component of this pathway is the GTPase Tem1, which is positively regulated by the GEF Lte1 and negatively by the GAP complex composed of Bfa1 and Bub2. Activation of Tem1 leads in turn to the activation of the downstream kinases Cdc15 and Dbf2/Mob1. Despite several studies over the last few years, some regulatory steps of FEAR and MEN pathways are still not fully understood. For example the GEF Lte1 is not essential at temperatures higher than 23 °C, implying that other components might be involved in Tem1 activation. In order to better understand how the FEAR and MEN pathways are regulated on a molecular level, a genetic screen was performed to identify novel MEN and FEAR components. One putative candidate, named FAR9, was found as a positive regulator of mitotic exit. Epistatic and functional analysis specified Far9 as an activator working upstream of Tem1 in MEN signaling. Far9 has a forkhead-associated domain (FHA-domain), which is a phosphoprotein recognition domain essential for the role of Far9 in MEN activation. Finally, the GAP complex Bfa1-Bub2 was identified as one regulatory target of Far9.