English Title: Structural and functional analysis of ligand recognition of toll-like receptor 9

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Abstract

CpG-reiche DNA, insbesondere bakterielle DNA, stellt durch die Aktivierung von Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) einen Stimulus für das angeborene Immunsystem dar. Dieser Stimulus kann durch synthetische Oligodesoxynukleotide (ODN), welche ein zentrales CpG-Motiv beinhalten (CpG-ODN), nachgestellt werden. Die strukturellen Einzelheiten der CpG-Erkennung sind jedoch weitestgehend unbekannt. Es wurde gezeigt, dass stimulative CpG-ODN nützlich sind, um Immunantworten bei Allergien, Infektionen und Krebs zu beeinflussen. Kürzlich wurde berichtet, dass die Stimulation von TLR9 durch endogene DNA zur Pathogenese von Autoimmunkrankheiten beitragen könnte. In dieser Arbeit wurden die funktionellen und strukturellen Wechselwirkungen zwischen Ligand und Rezeptor genauer analysiert. Hierzu wurden Mutationsstudien in der TLR9 Extrazellulärdomäne (ECD) und die Analyse strukturell modifizierter ODN durchgeführt. Die ECD von TLR9, welche die Ligandenbindung vermittelt, besteht aus 25 Leucin-rich repeat (LRR) Motiven. Fünf der LRRs tragen Insertionen, welche nicht mit dem LRR-Konsensus-Motiv übereinstimmen. Hier wurde gezeigt, dass die funktionelle Integrität der TLR9-ECD durch die Deletion einzelner LRR-Motive zerstört wird. Durch Deletion der inserierenden Sequenzen selbst konnte beobachtet werden, dass LRR2, LRR5 und LRR8 zur Rezeptoraktivierung durch CpG-ODN beitragen. Diese Deletionen zeigten keinen Einfluss auf die Rezeptordimerisierung, inhibierten jedoch die Bindung von CpG-DNA. Darüber hinaus wurde die Bedeutung eines Nukleinsäure bindenden Motivs innerhalb der Insertion von LRR8 bestätigt. Basierend auf einem Homologiemodell wurde ein positiv geladener Bereich im N-Terminus identifiziert, welcher für die CpG-induzierte TLR9-Aktivierung ebenfalls essentiell ist. Diese Interaktionen entsprechen Befunden, welche für die strukturelle Erkennung von doppelsträngiger RNA durch TLR3 erhoben wurden, und deuten somit auf ein generelles Prinzip der Nukleinsäureerkennung durch TLRs hin. Durch die Analyse von modifizierten, synthetischen Phosphodiester CpG-ODN konnte gezeigt werden, dass CpG-ODN höchstwahrscheinlich in partiell doppelsträngiger Konformation, die aufgrund der Ausbildung intermolekularer Duplexstrukturen vorliegt, erkannt werden. Strukturen, die eine intramolekulare Duplexbildung förderten, inhibierten die CpG-Aktivität nicht. Des Weiteren wurde gezeigt, dass multimerisierende ODN, welche eine 5’-Aminomodifikation enthielten, zu einer starken Interleukin 6-Induktion in humanen Immunzellen führten. Zusätzlich wurde ein suppressives Guanosin-reiches ODN (G-ODN) identifiziert, welches die Aktivierung von TLR9 durch stimulative CpG-ODN inhibierte. Das G-ODN war in vitro sowohl in Makrophagen und Dendritischen Zellen als auch in humanen plasmazytoiden Dendritischen Zellen suppressiv. G-ODN inhibierte die Sekretion von Tumor-Nekrosefaktor alpha und Interleukin 12p40 und beeinträchtigte die Hochregulation von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II und von kostimulatorischen Molekülen. G-ODN wirkte auch bei einem molaren Verhältnis von 1:10 (G ODN:CpG-ODN) und noch bei Zugabe sieben Stunden nach der CpG-ODN-Stimulation inhibitorisch. G ODN inhibierte spezifisch TLR9, jedoch keine anderen TLRs. Die Hemmung war von fünf Guanosinen in Folge abhängig und beeinträchtigte das proximale TLR9-Signal. Eine Wirkung von G ODN auf die Aufnahme konnte ausgeschlossen werden. Somit repräsentiert G-ODN eine Klasse von suppressiven ODN, welche in Situationen pathologischer TLR9-Aktivierung, wie es für einige Autoimmunkrankheiten vorgeschlagen wurde, von therapeutischem Nutzen sein könnte.

Translation of abstract (English)

CpG-rich DNA (CpG-DNA), especially bacterial DNA, provides a stimulus for the innate immune system by activating Toll-like receptor 9 (TLR9). This stimulus can be mimicked by synthetic oligodeoxynucleotides (ODN) containing a central CpG-motif (CpG-ODN) but the structural details of CpG-DNA recognition by TLR9 are still mostly unknown. Stimulatory CpG-ODNs have been shown to be valuable in modifying immune responses in allergy, infection and cancer. Recently, it was reported that stimulation of TLR9 by endogenous DNA might contribute to the pathogenesis of autoimmune diseases. Within this work the functional and structural interplay between ligand and receptor was analysed in detail. Therefore, mutational studies of the TLR9-ectodomain and testing of structurally modified ODN were performed. The extracellular domain (ECD) of TLR9 is responsible for ligand binding and is composed of 25 leucine-rich repeat (LRR) motifs. Five of the LRRs bear inserting sequences that do not conform to the LRR consensus motif. Here it is shown that the functional integrity of the ECD of TLR9 is lost by deletion of individual LRR motifs. When deleting only the inserting sequences it was observed that LRR2, LRR5 and LRR8 contribute to receptor activation by CpG-DNA. These deletions did not affect receptor dimerization but inhibited CpG-DNA binding. Furthermore the importance of a nucleic-acid binding motif within the insertion of LRR8 was confirmed. Based on a homology modeling a positively charged region in the N-terminus that is essential for CpG-DNA-induced TLR9 activation was identified additionally. This interaction site mirrors findings previously shown for the structural recognition of double-stranded RNA by TLR3. By testing modified synthetic phosphodiester CpG-ODN it could be shown that CpG-ODNs are most probably recognized in a partially double-stranded conformation that occurs due to intermolecular duplex formation. Structures that favored intramolecular duplex formation did not inhibit CpG-ODN activity. Furthermore, probably multimerising CpG-PO-ODNs containing 5’-amino modification were shown to be a strong inducer of IL6 in human immun cells. In addition a suppressive, guanosine-rich ODN (G-ODN) was identified that inhibited the activation of TLR-9 by stimulatory CpG-ODNs. G-ODN was suppressive in murine macrophages and dendritic cells as well as in human plasmacytoid dendritic cells in vitro. G-ODN blocked the secretion of tumour necrosis factor alpha and interleukin-12p40 and interfered with the upregulation of major histocompatibility complex (MHC) class II and costimulatory molecules. G-ODN was inhibitory even at a molar ratio of 1:10 (G-ODN:CpG-ODN) and when administered up to 7 h after stimulation with CpG-ODN. G-ODN specifically inhibited TLR9 but not other TLRs. Inhibition was dependent on a string of five guanosines and interfered with upstream TLR9 signalling. It could be excluded that G ODN acts at the stage of cellular uptake. G-ODN therefore represents a class of suppressive ODNs that could be of therapeutic use in situations with pathologic TLR9 activation, as has been proposed for certain autoimmune diseases.