English Title: Characterization und functional analysis of exosomes derived from human body fluids

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Abstract

Exosomen sind Vesikel endosomalen Ursprungs, die durch Fusion von Multivesicular-Bodies mit der Plasmamembran in den extrazellulären Raum sekretiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Exosomen aus verschiedenen Zelllinien und Körperflüssigkeiten charakterisiert und deren immunmodulatorische Funktionen und Einflüsse auf Tumorwachstum untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Exosomen aus Ovarialkarzinomzellen von eigenen und fremden Zellen über einen zum Teil phosphatidylserinabhängigen Mechanismus aufgenommen werden. In vielen Tumoren korreliert die Expression von CD24 mit einer schlechten Prognose für die Patienten. In dieser Arbeit wurde CD24 als neuer Marker für Urinexosomen etabliert und dessen Expression als unabhängig vom Krankheitsverlauf und vom Zeitpunkt der Entnahme dargestellt. Als Herkunftsort der CD24-positiven Urinexosomen wurde das renalen System identifiziert. Die Sekretion von CD24-haltigen Exosomen, über den Urin, stellt ein im humanen und murinen Organismus konserviertes System dar und ist bereits im Fetus aktiv. Bei einer Schwangerschaft wird ein Großteil des Fruchtwassers durch den fetalen Urin gebildet. Wir konnten eine Methode entwickeln, um fetale von potentiell maternale Exosomen aus dem Fruchtwasser zu trennen und biochemisch zu analysieren. Dies ermöglichte erstmals die fetale Abstammung von CD24-positiven Exosomen im Fruchtwasser nachzuweisen. Die Invasion des Trophoblasten, in die Uterusschleimhaut während der Schwangerschaft, geht mit einer funktionellen Umgestaltung des Gewebes einher. Zahlreiche NK-Zellen werden dabei in den Uterus rekrutiert und besitzen dort einen im Vergleich zu den peripheren NK-Zellen im Blut veränderten Phänotyp. Uterine NK-Zellen sind zum Großteil zytokinsekretierend und nur wenige besitzen zytolytische Eigenschaften. Die dargestellten Ergebnisse beschreiben erstmalig eine Rolle von Exosomen beim intrauterinen Phänotypwechsel von NK-Zellen. Untersuchungen von Fruchtwasserexosomen, die mit NK-Zellen kultiviert wurden, bestätigten deren funktionelle Bedeutung bei einer Suppression des Immunsystems. Vergleichende Analysen von Aszites- und Serumexosomen unterschiedlicher Patienten zeigten eine Heterogenität in der Proteinzusammensetzung. Der Nachweis von EpCAM auf CD24-positiven Aszitesexosomen bestätigte deren Abstammung vom Tumor. Weiterhin konnte ein Übertritt von Aszitesexosomen aus dem Bauchraum in das Blut und damit eine systemische Wirkweise belegt werden. Im murinen Tumorwachstumsmodell führte die Applikation von Aszitesexosomen zu einem verstärkten Wachstum der Tumore. Die dargestellten Ergebnisse zeigen vielseitige biologische Funktionen von Exosomen. Ihr mögliches Potential für einen prognostischen Nutzen wird diskutiert.

Translation of abstract (English)

Exosomes are vesicles of endosomal origin, which are secreted into the extracellular space by fusion of multivesicular bodies with the plasma membrane. In this thesis, exosomes from different cell lines and body fluids were characterized and their influence on the immune system and tumor growth was analyzed. We could show that secreted exosomes from ovarian carcinoma cells were taken up by the cells themselves. Uptake by NK cells involves phosphatidylserine on exosomes. In many tumors, the expression of CD24 correlates with poor prognosis for the patients. Here it is shown that the GPI-anchored glycoprotein CD24 can be used as new marker for urinary exosomes, whose expression is independent of the course of disease and of the time of donation. We identified the renal system as the source of the CD24-positive urinary exosomes. This thesis demonstrates that the secretion of CD24 containing exosomes is a conserved mechanism in mice and men and is already active in the fetus. During pregnancy, the main part of amniotic fluid is build by the fetus’ urine. While only few details are known about amniotic fluid derived exosomes, we could establish a purification method for separating fetal and potentially maternal exosomes. In view of the emerging role of exosomes in immune modulation, we could show that CD24-positive exosomes are derived from the fetus and not from the mother. The invasion of the trophoblast into the uterus mucosa is accompanied by a functional reorganization of the tissue and the located cells. NK cells become recruited to the uterus and thereby showing a modified phenotype in comparison to peripheral blood NK cells. This work gives the first evidence for an intrauterine phenotype switch mediated by amniotic fluid exosomes. Comparative analysis of ascites and serum exosomes derived from different patients show diversity in their composition. This study also demonstrates a transfer of ascites exosomes into the blood and thereby implying a systemic mode of action. Additionally, the administration of ascites exosomes leads to an augmented tumor growth in a murine tumor model. Summing up, this thesis suggests an important role of exosomes and discusses a putative diagnostic value for grading of tumors and for prenatal diagnostics.