German Title: Dynamische Modellierung des JAK2-STAT5 Signaltransduktionsweges zur Analyse der spezifischen Rollen der negativen Feedback-Regulatoren

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Abstract

Erythropoietin (Epo) acts as the key regulator of red blood cell development in mammals. During erythropoiesis, Epo initiates the JAK2/STAT5 signal transduction pathway that elicits pro-survival signals in erythroid progenitor cells. Therefore, the tight regulation of JAK2/STAT5 signaling is crucial for the fine-tuned balance of erythrocyte production. Recently, several factors regulating Epo-induced JAK2/STAT5 signaling have been identified. However, their relative contribution in controlling the dynamic behavior of JAK2/STAT5 signaling is poorly understood. To elucidate the specific roles of these negative regulators in attenuating the pathway, data-based mathematical modeling was employed. In this study, standardized protocols were established facilitating the generation of quantitative time-resolved data of Epo-induced JAK2/STAT5 pathway activation in primary erythroid progenitor cells and the hematopoietic cell line BaF3-EpoR, which is a frequently used model system to study EpoR signaling. For the fine-tuned overexpression of negative regulators in hematopoietic cells, an inducible Tet-On retroviral vector system was developed. Systematic comparison of stoichiometries and activation dynamics of Epo-induced JAK2/STAT5 signaling in CFU-E and BaF3-EpoR cells revealed fundamental differences between both cell types, emphasizing the importance of the use of primary cells in the investigation of EpoR signaling. Genome-wide expression profiling identified potential feedback regulators of Epo-induced JAK2/STAT5 signaling in CFU-E cells. To dissect the complex roles of negative regulators that employ different mechanisms to attenuate JAK2/STAT5 signaling, a data-based dynamic pathway model was established. Calibration of the mathematical model was performed using multiple experimental data sets of Epo-induced JAK2/STAT5 signaling monitored under different conditions. The estimated parameters were fully identifiable and displayed small confidence intervals, which are required for accurate simulations. Comprehensive model analysis identified the rapid recruitment of the phosphatase SHP-1 as major mechanism controlling the early-phase kinetics of pathway activation, while the two transcriptionally induced regulators SOCS3 and CIS were elucidated as modulators of the STAT5 steady-state phosphorylation level. Furthermore, global sensitivity analysis uncovered the concentrations of SHP-1 and JAK2 as well as the parameter SOCS3 expression as critical to control the integral signal strength of nuclear phosphorylated STAT5, which is proportionally linked to the survival of erythroid progenitor cells. In conclusion, by combining mathematical modeling with experimental data, the crucial regulators enabling the tight control of Epo-induced JAK2/STAT5 signaling were elucidated. The detailed understanding of the molecular processes and regulatory mechanisms of Epo-induced signaling during normal erythropoiesis can be further exploited to gain insights into alterations promoting erythroleukemia and related malignant hematopoietic diseases.

Translation of abstract (German)

Erythropoetin (Epo) ist der zentrale Regulator der Bildung roter Blutzellen in Säugetieren. Während der Erythropoese aktiviert Epo den JAK2/STAT5 Signalweg, der Überlebenssignale in erythropoetischen Vorläuferzellen auslöst. Daher ist die präzise Regulation des JAK2/STAT5 Signalweges wichtig für das feinabgestimmte Gleichgewicht der Produktion von Erythrozyten. Kürzlich wurden mehrere Faktoren identifiziert, die den Epo-induzierten JAK2/STAT5 Signalweg regulieren. Eine wesentliche Frage ist, zu welchem Anteil diese Modulatoren das dynamische Verhalten des JAK2/STAT5 Signalweges steuern. Um die spezifische Rolle der negativen Regulatoren bei der Abschaltung des Signalweges zu identifizieren, wurde ein datenbasierter mathematischer Modellierungsansatz gewählt. Zur Erzeugung quantitativer und zeitaufgelöster Daten der Aktivierung des Epo-induzierten JAK2/STAT5 Signalweges in primären erythroiden Vorläuferzellen und der hematopoetischen Zellinie BaF3-EpoR, die ein häufig genutztes Modellsystem für die Untersuchung von EpoR-Signalwegen ist, wurden standardisierte Protokolle etabliert. Desweiteren wurde ein induzierbares retrovirales Tet-On Vektorsystem entwickelt, um eine feinregulierte Überexpression von negativen Regulatoren in hematopoetischen Zellen zu ermöglichen. Der systematische Vergleich von Stöchiometrien und der Aktivierungsdynamik des Epo-induzierten JAK2/STAT5 Signalweges in CFU-E und BaF3-EpoR Zellen zeigte grundlegende Unterschiede zwischen beiden Zelltypen auf und verdeutlichte die Bedeutung von Primärzellen in der Untersuchung von EpoR-abhängigen Signalwegen. Durch eine genomweite Expressionsanalyse konnten potentielle negative Regulatoren des Epo-induzierten JAK2/STAT5 Signalweges in CFU-E Zellen identifiziert werden. Zur Untersuchung der komplexen Rolle von negativen Rückkopplungs-(feedback) Regulatoren, die den JAK2/STAT5 Signalweg durch unterschiedliche Mechanismen abschalten, wurde ein datenbasiertes Modell des JAK2/STAT5 Signalweges erstellt. Die Kalibrierung des Modells erfolgte mittels umfangreicher quantitativer Daten, die unter unterschiedlichen Bedingungen generiert wurden. Die bestimmten Parameter waren vollständig identifizierbar und wiesen kleine Konfidenzintervalle auf, die wichtig für akkurate Simulationen sind. Eine umfassende Modellanalyse identifizierte die schnelle Rekrutierung der Phosphatase SHP-1 als einen zentralen Mechanismus zur Regulierung der frühen Aktivierungsphase, während die zwei transkriptionell induzierten Regulatoren CIS und SOCS3 als Modulatoren der Phosphorylierung von STAT5 in der steady state-Phase nachgewiesen wurden. Darüber hinaus konnten durch eine globale Sensitivitätsanalyse die Konzentration von SHP-1 und JAK2 sowie der Parameter SOCS3 Expression als kritische Faktoren bei der Kontrolle der integralen Signalstärke des nukleären phosphorylierten STAT5 identifiziert werden, die proportional mit der Überlebensrate von erythropoetische Vorläuferzellen verknüpft ist. Zusammenfassend konnte durch die Kombination von mathematischer Modellierung und quantitativen experimentellen Daten die zentralen Regulatoren identifiziert werden, die eine präzise Kontrolle des Epo-induzierten JAK2/STAT5 Signalweges ermöglichen. Die detaillierten Erkenntnisse der regulatorischen Mechanismen von Epo-induzierten Signalwegen während der Erythropoese können weiterhin genutzt werden, um Einblicke in molekulare Prozesse zu gewinnen, die Erythroleukämien und verwandte hematopoetische Krankheiten induzieren.