German Title: Die Analyse der cis-rechtlichen Struktur der entwicklungswirksamen regulierte Gene im Zebrafisch Embryo

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Abstract

Während der embryonalen Entwicklung vertebrater Organismen wird die Genexpression durch cis-regulatorische Elemente streng kontrolliert. Die Interaktion dieser Elemente, gefolgt von der Rekrutierung der RNA Polymerase II Maschinerie, führt zur Initiation der Transkription, einer der bedeutendsten Schritte in der Regulation der Genexpression. Seit der Fertigstellung mehrer Säuger- und vertebrater Genome ist phylogenetic footprinting einer der am Häufigsten angewandten Methoden um cis-regulatorische Sequenzelemente zu identifizieren. Dadurch konnte gezeigt werden, dass nicht-kodierende Sequenzelemente, teilweise mit extremer Konserviertheit, Enhancer Funktionen besitzen können. In der hier vorgestellten Arbeit zeige ich die Identifizierung von konservierten nicht-kodierenden Elementen und die Untersuchung ihrer Funktionalität als Enhancer in vivo in transient transgenen Zebrafischembryonen am Beispiel des pax2 Locus. Konservierte nicht-kodierende Sequenzen die als Enhancer fungieren, zeigen ein signifikant erhöhtes Vorkommen in der Nähe von entwicklungsspezifischen Regulatoren und Transkriptionsfaktoren. Im zweiten Teil meiner Arbeit stelle ich eine Methode vor, die eine Kombination aus globalem- und lokalem Alignment darstellt und zur Identifizierung einer größeren Anzahl konservierter nicht-kodierender Sequenzelemente mit Enhancer-Funktion führt als bisherig verwendete Methoden. Die Mehrzahl der identifizierten Elemente wurde während der Evolution durcheinander gemischt („shuffled“). Obwohl die Mehrzahl dieser shuffled-konservierten Elemente auch hier der Ontologieklasse von Transkriptionsfaktoren und Entwicklungsregulatoren zugewiesen werden konnte, wurde jedoch auch ein erhöhtes Vorkommen in anderen Ontologieklassen festgestellt, die Gene beinhalten, die für extrazellulare Regionen und Verhalten kodieren. Eines der Hauptprobleme, das sich nach der Identifizierung neuer Enhancer stellt, ist die Zuweisung von Genen, deren Expression durch den jeweiligen Enhancer beeinflusst werden, da diese durch große Sequenzbereiche voneinander getrennt sein können. Neuere Studien zeigen außerdem, dass die Diversität von Promotoren viel größer ist als ursprünglich angenommen. Da die Interaktion von Promotoren mit Enhancern durch Multiproteinkomplexe vermittelt wird, sollte die Zusammensetzung dieser Komplexe von der Eigenschaft des jeweiligen cis-regulatorischen Elements abhängig sein. Um zu ermitteln, ob die Sequenz des Kernpromoters und Enhancer die Spezifikation der Interaktion bestimmen, wurde ein high throughput screen durchgeführt, in dem 20 Kernpromotoren und 13 Enhancer zum Einsatz kamen, um 160 verschiedene Promoter/Enhancer Kombinationen zu generieren. Die Datenanalyse nach der automatisierten Bildgebung zeigte, dass die Enhancer-Funktion eindeutig promoterspezifisch ist und dass Promotoren die sich durch eine gute EST-Abdeckung auszeichnen signifikant aktiver sind und eine höhere Anzahl an Interaktionspartnern aufweisen.

Translation of abstract (English)

Transcription regulation during vertebrate embryonic development is tightly regulated by cis-regulatory elements and respective transcription factor complexes, which bind to them. The interaction of these elements, followed by the recruitment of the RNA polymerase II machinery, leads to transcription initiation, which is one of the major regulatory steps in gene expression regulation. In this thesis I study three aspects of cis regulatory function in the zebrafish embryo: 1. Non-coding genomic sequences, in some cases with extreme evolutionary conservation, were shown to harbour enhancer function. After the completion of several mammalian and vertebrate genomes, phylogenetic footprinting became frequently used methods for cis-regulatory element identification. I present the identification of conserved noncoding sequences in the pax2 locus and their in vivo test for enhancer activity in transient transgenic zebrafish embryos. 2. Conserved non-protein coding sequences working as enhancers were significantly enriched in and or around developmental regulators and/or transcription factor genes. In the second part of this thesis I present the application of a combined global and local alignment tool, which could identify higher number of conserved noncoding elements with enhancer activity, then any of the previous methods. Two thirds of the identified elements were shuffled during evolution. Although the majority of these shuffled conserved elements were still assigned to gene classes of transcription factors and developmental regulators, there were high enrichment in genes belonging to the extracellular regions and behavioural Gene Ontology classes. 3. The assignment of identified enhancers to their target gene promoters is often problematic, because of the potentially very large sequence distances separating them. Furthermore, based on recent results, promoters show an unexpected diversity. As promoter-enhancer interaction is mediated through multiprotein complexes, the composition of these complexes is likely dependent on the properties of the cis-regulatory elements involved and may result in interaction specificities. To investigate whether the DNA sequence of core promoters and enhancers define the specificity of their interaction, we have performed a high throughout screen, where 20 core promoters and 13 enhancers were used to generate 260 combinations. Data analysis after the automated image acquisition and processing revealed that enhancer function is clearly promoter-specific.