German Title: Biochemische und Mechanische Untersuchung der kardialen Titin-Isoformen

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Abstract

SUMMARY Background: Titin is a giant elastic protein of muscle sarcomeres. Titin molecules link the Z-disk with the M-line and have structural, elastic and signaling functions in myocytes. The primary structure determination of several titin isoforms and the mechanical characterization of different muscle tissues revealed that titin elasticity depends on the differential splicing of the titin spring region consisting of immunoglobulin-like domains, a so-called PEVK domain and larger unique sequence insertions like N2-B. The molecular weight of a titin isoform is correlated with its mechanical, spring-like properties: the smaller the isoform, the stiffer the spring. Heart muscles of mammalian organisms co-express two major classes of titin isoforms: the stiff N2B-titin and the compliant N2BA-titin. Sarcomeric stiffness is tuned by altering the expression ratio of N2BA:N2B titins, whereas the amount of total titin in a sarcomere likely is constant owing to stoichiometric constraints. Objectives of the study: 1) To determine the patterns of titin isoform expression in different muscle tissues using MDa-range high-resolution gel electrophoresis and Western blotting; 2) To understand the functional significance of the expression of various cardiac titin isoforms; 3) To look for variations in cardiac titin expression in diseased myocardium; 4) To establish conditions/factors determining different expression patterns of cardiac titin; 5) To understand consequences of pathological changes in titin protein expression for the heart. Methods and Results: N2BA to N2B titin isoform ratio was determined by loose-gel electrophoresis. The titin isoform ratio differed between: 1) Hearts from different mammalian species; 2) Various regions of the same heart; 3) Diseased and normal human hearts. Western blotting using sequence assigned anti-titin antibodies confirmed the identity of the titin bands. The N2BA proportion varied from ~5% in rat left ventricle to almost 70% in cow right ventricle. The N2BA:N2B ratio was generally higher in the right ventricle than in the corresponding plane of the left ventricle and decreased from the base to the apex of a given heart (assessed in goat and rabbit). Titin isoform expression was altered under disease conditions: human heart transplants due to coronary artery disease (CAD) exhibited an average N2BA:N2B ratio of 47:53, whereas normal donor hearts had a ratio of ~30:70. Increased expression of larger N2BA titin isoforms was also seen in failing myocardium of dilated cardiomyopathy (DCM) patients. Coexpression of N2BA-titin and N2B-titin in a sarcomere was demonstrated by immunofluorescence microscopy. A regular cross-striated staining pattern for titin on tissue sections of CAD-transplant hearts indicated uniform changes of titin expression instead of titin structural damage. The functional relevance of the observed changes in titin isoform expression was estimated in mechanical experiments on isolated myofibrils from human hearts. Diseased (CAD, DCM) human myofibrils expressing elevated N2BA proportions had lowered passive stiffness compared to non-failing human myofibrils. Thus, sarcomeres can modify their passive tension by adjusting the N2BA:N2B titin expression ratio. Failing human hearts, even if they are globally stiffened (collagen upregulated), have more compliant myofibrils than normal donor human hearts. Titin isoform switching was also studied in a rat model of myocardial infarction (ligature of left anterior descending coronary artery). Titin gels showed that 43% of diseased hearts displayed a distinct N2BA-titin band, compared to only 14% of the hearts of sham-operated control rats, suggesting an isoform switch had occurred in this heart failure model. Conclusions: An improved titin detection method by modified 2% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis revealed the presence of multiple titin isoforms in different tissues. Results established that the elastic diversity of titin is altered in human heart disease and during development. The shift towards expression of more compliant titin isoforms in human heart failure alters mechanical properties of the cardiomyocytes, in particular the passive stiffness. The disease-induced shift in titin isoform ratio may also impair active contraction, e.g. by interfering with the ability of the heart to use the Frank-Starling mechanism.

Translation of abstract (German)

ZUSAMMENFASSUNG Hintergrund: Titin ist ein riesiges elastisches Protein der Muskelsarkomere. Titin-Moleküle verbinden die Z-Scheibe mit der M-Linie und haben strukturelle, elastische und Signalfunktionen in den Myozyten. Die Primärstrukturermittlung einiger Titinisoformen und die mechanische Charakterisierung verschiedener Muskelgewebe zeigten, dass die Titinelastizität durch differenzielles Spleißen der Titin-Federregion moduliert wird, indem unterschiedlich lange Segmente eingebaut werden bestehend aus Immunglobulin-artigen Domänen, einer so genannten PEVK-Region und größeren einzigartigen Sequenzinsertionen wie N2-B. Das Molekulargewicht einer Titinisoform korreliert mit seinen Federeigenschaften: je kleiner (kürzer) die Isoform, desto steifer die Feder. Die Herzmuskeln von Säugern koexprimieren zwei Haupt-Titinisoformen, das steife N2B-Titin und das weniger steife N2BA-Titin. Die Sarkomer-Steifigkeit wird durch Einstellung des Expressionsverhältnisses von N2BA zu N2B justiert, während die Gesamttitinmenge in einem Sarkomer wohl aufgrund stöchiometrischer Restriktionen konstant ist. Zielsetzungen der Arbeit: 1) Ermittlung des Titinisoformenexpressionsmusters in verschiedenen Muskelgeweben unter Verwendung von hochauflösender Gelelektrophorese und Western blot; 2) Aufzeigen der funktionalen Bedeutung der Expression verschiedener Herztitinisoformen; 3) Analyse möglicher Veränderungen in der Expression des Herztitins im kranken Myokard; 4) Etablierung von Faktoren, die für das Herz-Titinexpressionsmuster relevant sind; 5) Verstehen der Konsequenzen der pathologischen Änderungen in der Titinexpression für das kranke Herz. Methoden und Ergebnisse: Das N2BA:N2B Titinisoformenverhältnis wurde durch Elektrophorese unter Verwendung besonders poröser Polyacrylamidgele bestimmt. Das Titinisoformenverhältnis war unterschiedlich: 1) in den Herzen von verschiedenen Säugetier- Species; 2) in verschiedenen Regionen des gleichen Herzens; und 3) in kranken gegenüber normalen menschlichen Herzen. Western Blots unter Verwendung sequenzspezifischer Titinantikörper bestätigten die Identität der Titinbanden. Der N2BA-Anteil schwankte von ~5% im linken Ventrikel der Ratte bis nahezu 70% im rechten Ventrikel der Kuh. Das N2BA:N2B Verhältnis war im Allgemeinen im rechten Ventrikel größer als im linken Ventrikel und war an der Herzbasis leicht höher als an der Herzspitze ein und desselben Herzens (untersucht in Ziege und Kaninchen). Das Titinisoformenmuster war in kranken humanen Herzen verändert: in wegen Koronararterienkrankheit (CAD) transplantierten Herzen bestand ein durchschnittliches N2BA:N2B Verhältnis von 47:53, während normale Spenderherzen ein Verhältnis von ~30:70 zeigten. Ein erhöhter Expressionsanteil der größeren N2BA-Titinisoform wurde auch in den Herzen von Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie (DCM) beobachtet. Eine Koexpression von N2BA- und N2B-Titin im gleichen Sarkomer wurde mittels Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt. Ein regelmäßiges quergestreiftes Färbemuster für Titin auf Gewebeabschnitten von CAD-Herzen deutete auf eine uniforme Veränderung der Titinexpression hin, nicht aber auf strukturelle Schäden im Titin. Die funktionale Bedeutung der beobachteten Titinexpressionsveränderungen wurde in mechanischen Experimenten mit isolierten Myofibrillen menschlicher Herzen untersucht. Kranke Myofibrillen (CAD, DCM) mit erhöhtem N2BA-Anteil offenbarten eine abgesenkte passive Steifigkeit im Vergleich mit Myofibrillen aus normalen Donorherzen. Die Sarkomere konnten also ihre passive Spannung ändern, indem sie das N2BA:N2B Expressionsverhältnis modulierten. Insuffiziente humane Herzen haben demzufolge, selbst wenn sie global versteift sind (Kollagen hochreguliert), schlaffere Myofibrillen als normale menschliche Spenderherzen. Eine Titinisoformenveränderung wurde auch an einem Rattemodell mit experimentellem Myokardinfarkt nach LAD-Ligatur untersucht. Titingele zeigten, dass 43% der kranken Herzen eine eindeutige N2BA-Bande aufwiesen, während nur 14% der Herzen Sham-operierter Tiere eine N2BA-Bande zeigten. Die Befunde demonstrierten, dass in diesem Tiermodell eine Titin-Isoformenveränderung hin zu N2BA induzierbar war. Schlussfolgerungen: Eine verbesserte Titinisoformendetektion durch Verwendung niedrigprozentiger (2%) SDS-Polyacrylamid-Gele offenbarte das Vorhandensein vieler verschieden großer Titinisoformen in unterschiedlichen Muskelgeweben. Die Arbeit dokumentiert die elastische Vielfalt des Titins sowie deren Veränderungen bei menschlichen Herzerkrankungen und in der Entwicklung. Die Veränderung hin zu schlaffen N2BA-Isoformen im terminal insuffizienten humanen Herzen beeinflusst die mechanischen Eigenschaften der Kardiomyozyten, insbesondere deren passive Steifigkeit. Die krankheitsbedingte Verschiebung im Titinisoformenverhältnis könnte auch die Kontraktilität verschlechtern, indem z.B. die Fähigkeit des Herzens, den Frank-Starling-Mechanismus zu verwenden, behindert wird.