German Title: Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Kandidatengenen in häufigen Zugewinnregionen im Mantelzell Lymphom und in chronisch lymphatischer Leukämie

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Abstract

The two B cell non-Hodgkin lymphoma entities chronic lymphocytic leukemia (CLL) and mantle cell lymphoma (MCL) are lymphoproliferative neoplasms characterized by different aggressive clinical courses. However, they show striking geneotypic similarities like recurrent chromosomal gains of 3q25 q29, 12q13 q14 and 18q21-q22. The genetic pathomechanisms affected by these aberrations are mainly not understood. Several studies reported the high resolution detection of chromosomal imbalances in MCL and CLL using array CGH, accurately defining the gained regions. These imbalances, however, still contain too many genes in order to enable a reasonable selection of candidates. The aim of the present study was to identify genes with oncogenic potential in recurrently gained chromosomal regions of MCL and CLL using high resolution expression arrays, followed by studying the effect of gene silencing on cell proliferation. First, the expression of 24 primary CLL and 6 primary MCL patients, as well as 6 cell lines was profiled, and the identified genes in the three gained regions (3q, 12q, and 18q) were compared to published data. Second, the 72 candidate genes derived from this analysis were functionaly investigated by the use of an RNA interference screen in a multiwell format. Third, the changes in cell viability were validated in primary CLL cells and downstream effects of the identified candidate genes were analyzed. The three genes CCDC50, SERPINI2 and SMARCC2 emerged as candidates mediating a reduction in cell viability in cell lines and in primary CLL cells. CCDC50 was identified as a candidate gene with a 3.5-fold mean overexpression in primary cells of MCL and CLL patients. Gene knockdown and reporter gene assays revealed a role of CCDC50 in promoting cell survival. MCL and CLL cell lines with stable CCDC50 knockdown revealed 75% less proliferation than the parental cells. Interestingly, and in contrast to results shown in Hela cells, the data of this study gave rise to a survival stimulating effect of CCDC50. TNF alpha induced NFkB activation revealed a direct correlation of inducibility and CCDC50 expression. Genome wide expression profiling studies identified several target genes of p53 signaling pathways as upregulated in accordance with low CCDC50 transcript levels. Overexpression of pro-apoptotic genes like TP53I3 and BAX and downregulation of apoptosis-protecting genes like BNIP3L and GADD45A were a plausible cause for the reduction in cell viability in primary CLL cells and cell lines after CCDC50 silencing. In conclusion, CCDC50 was identified as activated candidate gene in MCL and CLL that is responsible for cell survival and plays a role in NFkB and p53 signaling pathways.

Translation of abstract (German)

Die beiden B-Zell Non-Hodgkin Lymphome, chronisch lymphatische Leukämie (CLL) und Mantelzell-Lymphom (MCL), sind als lymphoproliferative Neoplasien durch unter-schiedlich aggressive Krankheitsverläufe charakterisiert. Dennoch zeigen sie ausgeprägte Gemeinsamkeiten genetischer Natur. Häufig auftretende Veränderungen sind zum Beispiel genetische Zugewinne auf den Chromosomen 3q25-q29, 12q13-q14 und 18q21-q22. Die Pathomechanismen, die durch diese Aberrationen ausgelöst werden, sind größtenteils noch nicht aufgeklärt. Die Methode „array CGH“ (vergleichende genomische Hybridisierung auf Biochips) ermöglicht es, genomweite Veränderungen der DNA-Kopienzahl, die durch den Zugewinn oder den Verlust bestimmter Chromosomen-regionen entstanden sind, sehr sensitiv zu erkennen. Amplifizierte Regionen in MCL und CLL enthalten oftmals Onkogene, die bei der Tumorentstehung und entwicklung eine entscheidende Rolle spielen. Viele Publikationen, in denen die array CGH Methode benutzt wurde, konnten die veränderten Chromosomenregionen in MCL und CLL auf so genannte “minimal veränderte Regionen“ eingrenzen. Trotzdem enthalten diese noch zu viele Gene, um eine geeignete Auswahl an Kandidaten für weitere funktionelle Studien treffen zu können. Das Ziel dieser Studie war es, Kandidatengene mit onkogenem Potential zu identifizieren, die in häufig amplifizierten chromosomalen Regionen von MCL und CLL liegen. Dazu wurden umfassende Expressionsprofile von primären Zellen aus 24 CLL und 6 MCL Patienten sowie von 6 Zelllinien beider Entitäten erstellt. Die 72 identifizierten und überexprimierten Kandidatengene, die in den häufigen Zugewinnregionen 3q25-q29, 12q13-q14 und 18q21-q22 lokalisiert sind, wurden mittels der RNA Interferenz-Methode antagonisiert. Abschließend wurden die beobachteten Verluste in der Zellviabilität in Zelllinien und in primären CLL-Zellen durch den Einsatz von vier einzelnen siRNA-Sequenzen pro Gen validiert. Die Gene CCDC50, SERPINI2 und SMARCC2 wurden dabei als Kandidatengene bestätigt, deren mRNA Knock-down sowohl den Verlust der Zellviabilität in primären Zellen als auch in Zelllinien induzierte. CCDC50 konnte schon in früheren Studien als überexperimiertes Gen in MCL im Vergleich zu anderen Leukämien und zu gutartigen Lymphknotengeweben identifiziert werden. In dieser Arbeit zeigten quantitative PCR Messungen eine mittlere 3.5-fache Überexpression in primären Zellen der Lymphome MCL und CLL. Reportergenanalysen belegten darüber hinaus, dass CCDC50 im NFκB-Signalweg beteiligt ist, der u.a. die Viabilität von MCL- und CLL- Zellen reguliert. Weiterhin wurden Zelllinien mit stabilem CCDC50 Knock-down generiert. Diese zeigten eine bis zu 75% verminderte Zellproliferation im Vergleich zu parentalen Zellen mit unveränderter CCDC50- Expression. Im Gegensatz zu Experimenten, die in früheren Studien in Hela-Zellen durchgeführt wurden, belegten die Ergebnisse in diesen Untersuchungen einen stimulierenden Effekt von CCDC50 auf das Überleben und die Proliferation von MCL und CLL Zellen. Die TNF alpha-induzierte NFkB-Aktivität konnte in HEK-293T-Zellen direkt mit dem CCDC50-Expressionslevel korreliert werden. Durch genomweite Expressionsstudien, die nach der Modifikation der CCDC50-Expression durchgeführt wurden, konnte eine Mehrzahl von Genen aus dem p53-Signalweg als dereguliert identifiziert werden. Die Überexpression der Apoptose-induzierenden Gene TP53I3 und BAX, sowie eine Herunterregulierung von Genen, die vor Apoptoseinduktion schützen (z.B. BNIP3L und GADD45A), sind eine plausible Erklärung für die Reduktion der Zellviabilität nach CCDC50 Knock-down in primären CLL-Zellen sowie in Zelllinien. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit CCDC50 als hochreguliertes Gen identifiziert werden, das in MCL und CLL die Zellproliferation fördert und an den NFkB- und p53-Signalwegen maßgeblich beteiligt ist.