English Title: Specific labeling of the Chemotaxis-protein CheY in living E.Coli for the investigation of diffusion processes by using diffusion imaging microscopy

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Abstract

Eine Weiterentwicklung des SNAP-Tag Systems wurde erfolgreich eingesetzt, um das Chemotaxis Protein CheY in lebenden E. coli Bakterien hochspezifisch mit dem Farbstoff MR121 zu markieren. Unter Ausnutzung der Fluoreszenzlöschung des MR121 durch das Substrat Benzylguanin konnte die unspezifische Hintergrundfluoreszenz in lebenden Bakterien durch nicht gebundene Fluorophore um mehr als 90 % reduziert werden. Diese Reduktion ist ein sehr wichtiger Schritt im Hinblick auf die Anwendbarkeit hochspezialisierter fluoreszenzmikroskopischer Techniken und macht den SNAP-Tag zu einer sehr guten Alternative zu den fluoreszierenden Proteinen, deren mangelnde Photostabilität oftmals Einzelmolekülstudien entgegen steht. Unter Anwendung der bildgebenden Diffusionsmikroskopie (DIFIM) war es möglich, die Diffusionszeit des CheY innerhalb lebender E. coli Bakterien zu bestimmen und Heterogenitäten in verschiedenen Bereichen in den Zellen zu aufzulösen. Mit der Chemotaxis, die die Bewegung der Bakterien steuert, konnte mit dieser Methode erstmals eine biologisch hochrelevante Fragestellung bearbeitet werden. Zusätzliche Standard-FCS-Messungen in wässrigen Proteinlösungen in physiologischen Konzentrationsbereichen können zu einer Eichung der erhaltenen Diffusionszeiten dienen und somit die Interpretation von Messungen in biologischen Proben erleichtern. Untersuchungen der spektroskopischen Eigenschaften von Quantum Dots zeigten, dass auch sie grundsätzlich dazu genutzt werden können, intelligente, fluoreszenzgelöschte Sondensysteme zu entwickeln.

Translation of abstract (English)

A modification of the commercially available SNAP-Tag system was successfully applied to specifically label the chemotaxis protein CheY in living E. coli bacteria with the photostabile organic fluorophore MR121. The exploitation of the fluorescence quenching of MR121 by the benzylguanine substrate leads to a significant decrease of unspecific background fluorescence by about 90 %. This reduction of background fluorescence strongly increases the applicability of the SNAP-Tag in sophisticated fluorescence microscopy techniques and makes it a powerful alternative to fluorescent proteins, which in general do not feature the needed spectroscopic properties for single molecule purposes. By using the diffusion imaging microscopy (DIFIM), it was possible to follow the diffusion of CheY and to resolve heterogeneities in different areas of the bacteria cells. These investigations on the bacterial chemotaxis were the first biologically relevant experiments that have been performed with the new DIFIM technique. Standard-FCS measurements in highly concentrated aqueous protein solutions have been done for calibration and to increase the interpretability of acquired diffusion times in more complex biological systems. Investigations on the spectroscopic properties of Quantum Dots showed that specific fluorescence quenching by thymidine might well open up an access to the design of intelligent probes.