German Title: Biochemische und funktionelle Charakterisierung des Non Specific Lethal Complex

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Abstract

Genomic DNA is not freely accessible but it is compacted into chromatin by wrapping DNA around a histone octamer. Basic unit of chromatin is a nucleosome. Accessibility of nucleosomal DNA highly regulated and is orchestrated by many proteins that combinatorially alter the positional phasing of nucleosomes by chromatin remodeling enzymes, substitution of variant histones, post-translational modification of nucleosomes and the partitioning of chromatin into specific nuclear locations. X chromosomal regulation by the process of dosage compensation provides an ideal model system to study the effect of chromatin and epigenetic factors on gene expression. In mammals, genes on the active X (Xa) chromosome are upregulated about twofold, with a corresponding inactivation of one of the two X chromosomes (Xi) ensuring equivalent sex chromosome expression in males and females. In Drosophila, dosage compensation is accomplished by the work of the MSL complex, which provokes a two-fold increase in the expression of genes on the male X chromosome. The MSL complex specifically binds to genes that require to be unregulated and, through the action of MOF, a histone acetyltransferase subunit within the complex, induces acetylation of H4K16, which is associated with an increase in the rate of transcription of genes. In contradiction to the classic view that MOF was restricted to the male X chromosome, it has been found recently by our lab that MOF binds to multiple sites on the autosomes in both sexes. This suggests that MOF has a role in transcriptional regulation beyond dosage compensation. The work presented in this thesis shows the purification of a novel complex of evolutionary conserved proteins, which contains MOF. We termed the complex the NSL complex (Non-Specific Lethal), as mutation of proteins of the complex is lethal to both sexes. The NSL complex is composed of the evolutionary conserved proteins MOF, NSL1, NSL2, NSL3, MCRS2, MBDR2, WDS, Z4 and Chromator. These components of the NSL complex broadly decorate all chromosomes, and overlap with MOF on the X chromosome(s), as well as on all autosomes in males and females. Colocalization of NSL complex members with MOF occurs at the level of individual genes, with NSL associated with the promoters of MOF-bound genes. Analysis of total RNA from fly lines expressing RNAi against NSLs specifically in salivary glands demonstrates that the binding of the NSL complex to promoters is functional, as there is a strong correlation between the absence of NSL and a decrease in transcription in males and females. Taken together, work performed in this thesis demonstrates that the NSL complex functions as a novel transcription regulator in Drosophila.

Translation of abstract (German)

Chromatin besteht aus DNA, die sich um Nukleosomen herumwindet. Die Nukleosomen haben voneinander einen mittleren Abstand von etwa 200 Basenpaaren (bp). Eine Regulation von Genexpression findet statt, indem der Zugang der RNA-Polymerase zur DNA durch Umbau der Chromatinstruktur (“chromatin remodeling”) und kovalente Modifikation von Histonen moduliert wird. Diese Vorgänge werden durch eine Vielzahl an Proteinen gesteuert, die in kombinatorischer Weise die Position und den Abstand der Nukleosomen zueinander verändern, Histonvarianten substituieren, Nukleosomen posttranslationell modifizieren und das Chromatin in spezifischen Regionen des Zellkerns positionieren. Der Prozess der Dosis-Kompensation (“dosage compensation”) bietet ein Modellsystem, um epigentische Mechanismen der Expressionsregulation zu untersuchen. In Säugern werden Gene auf dem aktiven X-Chromosom (Xa) auf etwa die zweifache Dosis hochreguliert, korrespondierend zu einer Inaktivierung eines der beiden X-Chromosomen (Xi), wodurch eine äquivalente Expression der Gonosomen in Männchen und Weibchen sichergestellt wird. In Drosophila wird Dosis-Kompensation durch den MSL-Komplex erreicht, der eine Verdoppelung der Expression von Genen auf dem männlichen X-Chromosom bewirkt. Der MSL-Komplex bindet spezifisch an Gene, die hochreguliert werden müssen und induziert mittels seiner Komplexuntereinheit MOF, einer Histonacetyltransferase, die Acetylierung von H4K16, welche mit einer gesteigerten Transkriptionsrate assoziiert ist. Im Gegensatz zu der klassischen Annahme, dass MOF auf das männliche X-Chromosom beschränkt sein solle, wurde vor kurzem gezeigt, dass MOF in beiden Geschlechtern an viele Regionen auf Autosomen bindet. Dies lässt vermuten, dass MOF eine über die Dosis-Kompensation hinausgehende Rolle bei der Transkriptionsregulation spielt. Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt die Aufreinigung eines neuen MOF-enthaltenden Komplexes konservierter Proteine, Wir haben ihn NSL-Komplex genannt (“Non-Specific Letal”/unspezifisch letal), da Mutation von Komplexkomponenten in beiden Geschlechtern letal ist. Der NSL-Komplex setzt sich zusammen aus den konservierten Proteinen MOF, NSL1, NSL2, NSL3, MCRS2, MBDR2, WDS, Z4 und Chromator. Die NSL-Komponenten interagieren über weite Strecken mit sämtlichen Chromosomen und überlappen dabei an vielen Stellen auf dem X-Chromosom (bzw. den X-Chromosomen) wie auch auf allen Autosomen mit MOF, sowohl in Männchen wie auch in Weibchen. Die Kolokalisation der NSL-Komponenten mit MOF geschieht auf der Ebene individueller Gene, wobei NSL mit dem Promotor MOF-gebundener Gene assoziiert. Die Analyse von Gesamt-RNA isoliert aus Drosophila-Linien, die eine RNAi gegen NSLs spezifisch in den Speicheldrüsen exprimieren, zeigt dass die Bindung des NSL-Komplexes an Promotoren funktionell relevant ist, da eine starke Korrelation zwischen der Abwesenheit von NSL und einer Abnahme der Transkription in Männchen und Weibchen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der NSL-Komplex eine allgemeine Rolle bei der Transkriptionsregulation spielt.