German Title: Untersuchung des Spleißens und der Bildung von mRNPs

Preview

PDF, English Download (5MB) | Terms of use

Abstract

Splicing is a fundamental step in eukaryotic gene expression. During this process, introns are excised from pre-mRNAs and exons are ligated to form a continuous reading frame. As a consequence of splicing, a number of proteins are deposited on the mRNA product. These proteins can influence a number of downstream processes of the mRNA metabolism, such as export from the nucleus, translation efficiency and stability in the cytoplasm. It becomes evident that splicing not only plays an important role in the maturation of an mRNA in the nucleus, but also influences distant downstream processes affecting the ultimate fate of mRNAs. The exon junction complex (EJC) is assembled ~20-24 nucleotides upstream of splice junctions in a splicing-dependent, but sequence-independent manner the presence of ATP (Ballut et al., 2005). Therefore, its assembly can occur in the absence of the physiological deposition machinery, the spliceosome. However, under these experimental conditions, its physiological assembly hierarchy was not determined. One of the goals of this thesis was to study EJC deposition during splicing. The stepwise assembly of EJC during splicing, in parallel to the spliceosome assembly was investigated. We used an in vitro splicing system that faithfully recapitulates the splicing-dependent deposition of EJC proteins. We found that eIF4A3 and MAGOH-Y14 formed a pre-EJC before exon ligation and that deposition of eIF4A3, MAGOH and Y14 required splicing, while Barentsz and UPF3b did not require splicing to bind at the EJC. These results show that the minimal EJC (eIF4A3 and MAGOH-Y14) assembles on mRNA prior to exon ligation, while Barentsz and UPF3b join the complex later, after the completion of splicing to form an NMD-competent core EJC. While studying the splicing-mediated deposition of EJCs, we noticed that MAGOH mutants lacking the interaction with PYM subtly but reproducibly co-immunoprecipitated more spliced MINX mRNA than wild type MAGOH. Therefore, we hypothesized that EJCs containing such mutants are more stable than EJCs with wild type MAGOH. To directly test if PYM influences the EJC, we purified recombinant PYM (rPYM) from bacterial expression cultures and added increasing amounts of rPYM to splicing reactions containing FLAG-tagged EJC proteins. The investigation led to the following observations: PYM reduced the amount of EJCs bound to spliced mRNAs and that the N-terminus of PYM was required for EJC disassembly. In addition, it was shown that PYM dissociated assembled EJCs but did not inhibit EJC assembly. These results reveal that PYM is an EJC disassembly factor in vitro that antagonizes important EJC functions. A number of protein complexes assemble on the mRNA in the nucleus, such as EJC and TREX. Evidence exists in the literature that EJC and TREX are connected. Some of the TREX complex components have been included into the EJC components (Gatfield et al., 2001; Le Hir et al., 2001b; Le Hir et al., 2000). It has yet to be demonstrated whether TREX complex deposition is EJC-dependent. We investigated the TREX complex deposition using the in vitro splicing system described before. The role of DDX39, a UAP56 paralogue protein, was addressed for the first time and compared to UAP56. The results revealed that TREX deposition was splicing-independent and in particular that the recruitment of UAP56 and DDX39 was EJC-independent, while ALY/REF interacted with the EJC. In addition, functional characterization of ALY/REF and UAP56 revealed that the ALY/REF residues 204-241 were required for binding to the cap fragment, but not to the EJC fragment and that UAP56 mutants did not precipitate unspliced pre-mRNA or spliced mRNA fragments. The splicing-independent TREX complex deposition suggests that splicing is not necessary for export, but it may enhance export of spliced mRNAs.

Translation of abstract (German)

Das Spleißen ist einer der grundlegenden Schritte der Genexpression in Eukaryonten. Durch den Spleißprozess werden Introns aus der pre-mRNA ausgeschnitten und die Exons zu einem durchgängigen offenen Leserahmenverknüpft. Als Folge des Spleißprozesses binden eine Reihe von Proteinen an die gespleißte mRNA. Diese Proteine beeinflussen andere Schritte des mRNA Stoffwechsels, z. B. den Export der mRNA aus dem Zellkern und die Effizienz der Translation und Stabilität im Zytoplasma. Das Spleißen spielt also nicht nur eine wichtige Rolle bei der Reifung von mRNAs im Zellkern, sondern bestimmt bei späteren Prozessen die endgültige Bestimmung von mRNAs. Der Exon Junction Complex (EJC) bindet an einer Position 20-24 Nukleotide vor Spleißverbindungen an die mRNA. Diese Bindung erfolgt spleißabhängig, ist jedoch vollkommen sequenzunabhängig (Le Hir et al., 2000). Wir wollten untersuchen, ob die Zusammensetzung von EJCs durch das von der Bindungsstelle stromab gelegene Intron beeinflusst werden kann. Frühere Arbeiten legten nahe, dass NMD kompetente mRNP Komplexe auf verschiedenen Wegen generiert werden können (Gehring et al., 2005). Ob die unterschiedlichen NMD kompetenten Komplexe mit unterschiedlich zusammengesetzten EJCs korrelieren war eines der zentralen Fragen unserer Untersuchungen. Hierfür etablierten wir die Affinitätsaufreinigung von mRNPs, die mittels Spleißen in vitro generiert wurden. Solche in vitro mRNPs wurden mittels GRNA Chromatographie aufgereinigt. Die Zusammensetzung der Proteine in den isolierten mRNPs konnte aber nicht mit Massenspektrometrie aufklärt werden, da die benötigte Menge an Protein nicht erreicht wurde. In Immunoblots konnten jedoch in den aufgereinigten mRNPs die Proteine eIF4A3 und UAP56 nachgewiesen werden. Der EJC kann in vitro aus seinen vier rekombinanten Proteinkomponenten in Anwesenheit von ATP auf einem RNA Substrat zusammengesetzt werden (Ballut et al., 2005). Dies bedeutet, dass er auch in Abwesenheit der physiologischen Spleißmaschinerie assemblieren kann. Der normale Ablauf des Zusammenbaus von EJCs konnte unter diesen Bedingungen aber nicht untersucht werden. Eines der Ziele dieser Doktorarbeit war die Untersuchung des EJC Zusammenbaus während des Spleißvorganges. Hierzu wurde der schrittweise Aufbau des EJC parallel zum Spleißvorgang untersucht. Mit Hilfe eines experimentellen Systems, das die spleißabhängige Assemblierung von EJC-Proteinen darstellen kann, fanden wir, dass eIF4A3 und MAGOH-Y14 bereits vor der Exon-Ligation einen pre-EJC bilden. Obwohl eIF4A3 und MAGOH-Y14 während des Spleißens zusammengesetzt werden, binden Barentsz und UPF3b später an den bereits assemblierten pre-EJC. Dies bedeutet, dass erst durch die Bindung von Barentsz und UPF3b nach dem Spleißen ein NMD-kompetenter EJC Kernkomplex gebildet wird. Während unserer Untersuchungen zur spleißabhängigen Assemblierung des EJC beobachteten wir, dass MAGOH Mutanten, die nicht mehr mit dem Protein PYM interagieren konnten, reproduzierbar mehr gespleißte mRNA immunpräzipitierten als der MAGOH Wildtyp. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass EJCs die diese Mutanten enthalten stabiler sind, als EJCs mit dem MAGOH Wildtyp. Um herauszufinden, ob PYM die Stabilität des EJC direkt beeinflussen kann, haben wir rekombinantes PYM (rPYM) bakteriell produziert und rPYM in Spleißreaktionen eingesetzt. Wir konnten zeigen, dass PYM die Menge von RNA-gebundenen EJCs verringert, und dass der N-Terminus von PYM für dieses Auseinanderbauen von EJCs benötigt wird. Wir fanden ausserdem, dass PYM zwar reife EJCs dissoziieren kann, nicht jedoch die Assemblierung des EJC während des Spleißens behindert. PYM ist also ein Faktor, der EJCs in vitro auseinanderbauen kann und der deshalb wichtigen Funktionen des EJC entgegenwirken kann. Eine Reihe von Proteinkomplexen bindet im Zellkern an die mRNA, z.B. der EJC oder der TREX-Komplex. Frühere Arbeiten konnten eine Verbindung zwischen dem EJC und dem TREX Komplex nachweisen. Einige der TREX Komponenten wurden ursprünglich als EJC Proteine angesehen (Gatfield et al., 2001; Le Hir et al., 2001b; Le Hir et al., 2000). Dennoch wurde bislang noch nicht gezeigt, ob die Rekrutierung des TREX Komplex in Abhängigkeit des EJC erfolgt. Wir haben die Bindung des TREX Komplexes an mRNA mit unserem in vitro Spleißsystem untersucht. Die Funktion des Proteins DDX39, ein Homolog von UAP56, wurde dabei ebenfalls analysiert und mit UAP56 verglichen. Unsere Arbeiten konnten zeigen, dass die Rekrutierung von UAP56 und DDX39 unabhängig vom EJC erfolgte, wohingegen ALY/REF mit dem EJC interagierte. Funktionelle Analysen zeigten, dass die Aminosäuren 204-241 von ALY/REF für die Bindung der mRNA Kappe benötigt wurden, jedoch nicht für die Interaktion mit dem EJC. UAP56 Mutanten banden weder an gespleißte, noch an ungespleißte RNAs. Die spleißunabhängige Bindung des TREX Komplex könnte darauf hindeuten, dass der Spleißvorgang nicht notwendig für den mRNA Export ist, diesen jedoch stimulieren kann.