English Title: Analysis of complex alterations within the MDM4-TP53-MDM2-regulation network of the hepatocellular carcinoma using array-based-Comparative Genomic-Hybridization

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Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der häufigste maligne primäre Lebertumor und zählt zu den häufigsten Krebserkrankungen weltweit. Auch in den westlichen Industrienationen ist eine steigende Inzidenz der Neuerkrankungen bei gleichzeitig schlechter Prognose zu verzeichnen. Zu den wichtigsten ätiologischen Faktoren gehören chronische Hepatitis B und C Virusinfektionen, sowie chronischer Alkoholabusus und die sog. nicht-alkoholische Steatohepatitis, die im Rahmen eines metabolischen Syndroms auftreten kann. Zur Identifikation neuer, für die Hepatokarzinogenese relevanter, chromosomaler Veränderungen und protumorigener Kandidatengene, wurde ein Kollektiv von 63 HCCs, das sich zu etwa gleichen Teilen aus o.g. Ätiologien rekrutierte, mittels array-basierter Comparativer Genomischer Hybridisierung (aCGH) analysiert. Kandidatengene wurden mittels Genexpressionsanalyse und funktioneller Assays anschließend weiter charakterisiert. Neben der ätiologie-abhängigen Überexpression des myc-Onkogens in virus- und alkohol-induzierten HCCs, wurden chromosomale Zugewinne auf 1q32 in etwa 70 % der HCCs nachgewiesen. Das durch eine minimale Überlappungsregion definierte Kandidatengen mdm4 zeigte hingegen eine ätiologie-unabhängige Überexpression auf. Funktionelle Analysen nach siRNA-vermittelter Inhibierung der MDM4–Expression zeigten in HCC-Zelllinien eine reduzierte Zellviabilität, beruhend auf verminderter Proliferation und erhöhter Apoptoserate. Dies deutet darauf hin, dass MDM4 im HCC als Onkogen fungieren kann. MDM4 ist, wie das ihm homologe, in zahlreichen Malignomen überexprimierte MDM2, Teil des MDM4-TP53-MDM2-Regulationsnetzwerks. Die weiteren Analysen dieses Regulationsnetzwerks zeigten, dass die tp53-Mutationsfrequenz, wie bereits für westliche HCCs beschrieben, mit 9,1 %, verglichen mit fernöstlichen oder afrikanischen Kollektiven (teilweise >50 %), gering war. Sowohl die proteasomale TP53-Degradation als auch die TP53-abhängige Transkription werden maßgeblich von der Expressionshöhe und dem Verhältnis MDM4-MDM2 beeinflusst. Die Analyse der Expression von MDM4, der Splicevariante MDM4-S und MDM2 auf mRNA- und Proteinebene und zeigte in 2/3 der untersuchten HCCs eine erhöhte MDM4-MDM2-Ratio, was eine prädominant transkriptionelle TP53-Inhibierung in HCCs bedeuten könnte. In weiteren funktionellen Untersuchungen konnte in TP53-Wildtyp Zellen (HepG2) sowohl nach MDM4, als auch nach MDM2 Inhibierung mittels RNA interference eine Reduktion der Zellvitalität verbunden mit einem vergleichbaren Apoptoseanstieg beobachtet werden. Diese Inhibierungen bewirkten jedoch keinen antitumoralen Effekt in tp53-mutierten Zellen (HuH7). Der in HepG2-Zellen nachgewiesene Effekt konnte durch eine Doppelinhibierung mit TP53- und MDM2-siRNA partiell umgekehrt werden, was für MDM4 nicht möglich war. Die simultane Inhibierung von MDM4 und MDM2 verstärkte die in HepG2 beobachteten Effekte. Ein kompetitiver Inhibitor der MDM2-TP53-Interaktion, Nutlin-3, zeigte in funktionellen Analysen an HepG2-Zellen einen Vitalitätsverlust sowie die Induktion eines Zellzyklusarrests. Dies war verbunden mit einer Stabilisierung der TP53- und einer Induktion der p21-Proteinexpression sowie einer MDM4-Reduktion. Im Gegensatz hierzu wiesen HuH7-Zellen nur einen leichten Vitalitätsverlust verbunden mit einer diskreten Apoptoseinduktion auf, ohne messbaren Einfluss auf die Proteinexpression. Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass der potentielle Vorteil einer medikamentösen Therapie, die MDM2 zur Zielstruktur hat (z.B. Nutlin-3), maßgeblich vom tp53-Mutationsstatus bestimmt wird. Zudem scheint der anti-tumorale Effekt, verglichen mit einer auf MDM4 zielenden Therapie, geringer ausgeprägt. Dies ist möglicherweise durch MDM4-vermittelte TP53-unabhängige protumorigene Effekte begründet, wie Analysen in der TP53-deletierten HCC-Zelllinie Hep3B nahelegen. Zusammenfassend ist MDM4 eine interessante Zielstruktur für die Entwicklung neuer pharmakologischer Inhibitoren, die nach entsprechender positiver experimenteller und prä-klinischer Testung die bislang schlechte Prognose des HCCs verbessern können.

Translation of abstract (English)

The hepatocellular carcinoma (HCC) represents one of the most common cancers worldwide and is the most common type of primary liver cancer. It shows an increasing incidence and the overall prognosis is poor. Different etiologies have been linked to HCC development, such as chronic hepatitis B and C infection, chronic alcohol consumption as well as nonalcoholic steatohepatitis. To identify new etiology-dependent and –independent chromosomal aberrations along with genes related to hepatocarcinogenesis a panel of 63 HCCs including above mentioned etiologies equally distributed was analyzed using array-based comparative genomic hybridization (aCGH). Selected candidate genes were validated by gene expression profiling and functional analyses. Besides etiology-dependent overexpression of the myc-oncogene in virus- and alcohol- induced HCCs we observed a chromosomal gain at 1q32.1 in 70 % of HCCs. The on 1q32.1 located mdm4-gene showed etiology-independed overexpression in HCCs. siRNA-mediated silencing of MDM4 expression significantly reduced cell viability, mainly due to decreased proliferation and increased apoptosis suggesting that MDM4 may act as an oncogene in a significant percentage of human HCCs. MDM4 as well as its homologue MDM2, that has been shown to be overexpressed in numerous cancers, are key regulators of TP53. As previously described for Western HCCs the frequency of tp53-mutation was comparably low (9.1 %) in our series compared to HCCs in patients from Asia or sub-Saharan Africa. Both proteasomal TP53-degradation and TP53-dependend transcription rely on the expression level as well as the MDM4-MDM2 ratio. The quantification of the relative expression of MDM4, the splice variant MDM4-S and MDM2 as well as the calculation of their ratios revealed an increased MDM4- MDM2 ratio in 2/3 of HCCs analyzed, implicating that function inhibition of tp53 in human HCCs occurs mainly via inhibition of TP53-dependent transcriptional activation. Further functional analyses using RNA interference confirmed that inhibition of both MDM4 and MDM2 reduced cell viability and increased apoptosis in tp53-wildtype cells (HepG2), whereas these treatments showed no anti-tumoral effect in tp53-mutated cells (HuH7). Additionally, the anti-tumoral effects were partially prevented following double inhibition of MDM2- and TP53 in HepG2-cells, whereas double inhibition of MDM4 and TP53 did not prevent the reduction in cell viability due to increased apoptosis. Additionally, double inhibition of MDM2 and MDM4 further increased the effects of the respective single inhibition in HepG2-cells. Treatment of HepG2-cells with Nutlin-3, a competitive small molecule inhibitor of MDM2-TP53-interaction, decreased cell viability and induced a cell cycle arrest via stabilization of TP53 and stabilization of p21 protein expression, whereas MDM4 expression was decreased. In contrast, this treatment only slightly decreased cell viability and increased the apoptosis rate in HuH7 cells without detectable changes in protein expression of MDM4, TP53, MDM2, and p21. Together, these data suggest that the efficacy of therapeutically targeting MDM2 (i.e. Nutlin-3) depends mainly on the tp53-mutation status. Furthermore these results indicate that targeting MDM2 exhibits a lower anti-tumoral potential than MDM4-targeting strategies, which may be due to TP53-independent protumorigenic functions of MDM4 as indicated in functional analysis following MDM4 knockdown in tp53-deleted Hep3B-cells.