German Title: Interplay zwischen Drosophila Importin-alpha2, beta und Kelch während der Oogenese und frühen Embryogenese

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Abstract

This work describes the interplay between importin-α2 (imp-α2), kelch and importin-β (imp-β) during two developmental periods of the fruit fly Drosophila namely, oogenesis and early embryogenesis. In particular, we emphasize on the role played by Imp-α2 in localizing Kelch to the ring canals (RC) during oogenesis. Imp-α2 is critically involved in RC assembly. In mutant imp-α2 females, the RCs are occluded and dumping of nurse cell cytoplasm into the oocyte is prevented. In the egg chambers, Kelch is synthesized but unable to bind RCs and mediate their opening. kelch mutations produce similar RC occlusion. In wild-type, Kelch strongly decorates RCs, yet Imp-α2 remains in the cytoplasm. Further analyses reveal no direct interaction between Kelch and Imp-α2, suggesting a mechanism by which Imp-α2 acts upon a factor regulating Kelch function (Gorjánácz et al., 2002). The first part of this study focuses on the interactions that take place between imp-α2 and kelch as well as kelch and imp-β . Using a sensitized background we were able to show that genetic interaction could take place between imp-α2 and kelch. Moreover, the interaction between imp-β and kelch is even stronger because we can detect interaction genetically and physically. Analysis of the distribution of Imp-α2 in wild type and kel∆ ovaries indicated an interdependence of Imp-α2 and Kelch in their cellular localization. Confocal analysis showed that the Kelch protein can be detected in preblastodermic embryos. Kelch was found to decorate the centrosomes and the spindle during mitosis although its pattern of distribution is generally distinct from that of Imp-α2 but overlaps during anaphase. The occurrence of both proteins in the nuclei during mitosis suggests that they may to interact. Hence, we suggest a new role for Kelch in mitosis during early embryogenesis. Further analysis showed that Imp-α2ΔIBB, which is unable to bind Imp-β, blocks oogenesis whereas Imp-α2NLSB-, which is able to bind an NLS bearing cargo protein, allows oogenesis to fully proceed in mutant imp-α2 females but subsequently arrests nuclear division in embryos, indicating that Imp-α2 exerts specific functions in distinct processes, such as RC assembly and mitosis. Genetic interaction between Kelch and Imp-β was detected by using the recessive imp-βRE34 allele whose binding affinity for Imp-α2 is affected. Heterozygous kelΔ/imp-βRE34 females, similar to imp-α2D14/imp-βRE34, produced eggs whose development was arrested during early embryogenesis. Moreover, pull-down assays showed that Kelch and Imp-β can physically interact. Based on our results we propose a model, wherein Imp-β could be the mediator between Imp-α2 and Kelch during oogenesis and that binding of Imp-α2 to Imp-β could release Kelch which will be able to gain access to RCs. In conclusion, this study reveals a possible mechanism through which Imp-α2 controls the localization of Kelch to RCs and a new role played by Kelch during early embryogenesis.

Translation of abstract (German)

Diese Arbeit beschreibt das Zusammenspiel von Importin-α2 (imp-α2), kelch und Importin-β (imp-β) im Verlauf der Oogenese und Embryonalentwicklung der Fruchtliege Drosophila melanogaster. Insbesondere untersuchten wir, welche Rolle Imp-α2 bei der Lokalisation von Kelch an den Ringkanal (RC) während der Oogenese spielt. Imp-α2 ist entscheidend an der Bildung des RC beteiligt. Im Weibchen der imp-α2 Mutanten sind die RCs verstopft und der Transport von Zytoplasma aus den Nährzellen in die Oocyte dadurch verhindert. In den Eikammern wird Kelch synthetisiert, kann aber an RCs nicht binden und die Öffnung bewirken. Kelch-Mutanten zeigen einen ähnlichen RC-Verschluß. In Wildtyp-Fliegen ist Kelch sehr stark an RCs assoziert. Imp-α2 jedoch verbleibt im Zytoplasma. Weitere Untersuchungen zeigten, dass keine direkte Interaktion zwischen Kelch und Imp-α2 besteht. Das könnte darauf hinweisen, dass ein Mechanismus existiert, durch den Imp-α2 mit Hilfe eines Faktors wirkt, der die Funktion von Kelch reguliert (Gorjánácz et al., 2002). Ziel des ersten Teils dieser Studien ist es, die Interaktion zwischen imp-α2 und kelch sowie zwischen kelch und imp-β zu untersuchen. Durch den Einsatz eines sensibilisierten Hintergrundes konnten wir zeigen, dass genetische Interaktion zwischen imp-α2 und kelch stattfinden kann. Noch stärker erwies sich die Interaktion zwischen imp-β und kelch, da wir genetische und physische Interaktion nachweisen können. Die Analyse der Verteilung von Imp-α2 im Wildtyp und kel∆ Ovarien läßt eine gegenseitige Abhängigkeit von Imp-α2 und Kelch bei ihrer zellulären Lokalisation vermuten. Untersuchungen am Confocalen Mikroskop zeigten, dass Kelch-Protein in Embryonen des Präblastodermstadiums nachweisbar ist. Kelch ist während der Mitose mit den Centrosomen und der Spindel assoziert, obwohl sein Verteilungsmuster normalerweise verschieden ist von Imp-α2, jedoch während der Anaphase überlappt. Da beide Proteine in den Kernen während der Mitose auftreten, kann man vermuten, dass sie miteinander interagieren. Es läßt uns daher schließen auf eine neue Rolle für Kelch bei den Mitosen während der frühen Embryonalentwicklung. Die weiteren Untersuchungen zeigten, dass Imp-α2ΔIBB, das nicht an Imp-β binden kann, die Oogenese blockiert, während Imp-α2NLSB-, das nicht in der Lage ist, an ein NLS-tragendes Cargo-Protein zu binden, es erlaubt, die Oogenese in mutanten imp-α2 Weibchen vollständig durchzulaufen, danach aber die Kernteilung in Embryonen arretiert. Diese Befunde lassen vermuten, dass Imp-α2 spezifische Funktionen in bestimmten Prozessen ausübt, wie RC-Assembly und Mitose. Genetische Interaktionen zwischen Kelch und Imp-β konnte mit Hilfe des rezessiven imp-βRE34 Allels, dessen Bindungsaffinität zu Imp-α2 verhindert ist, nachgewiesen werden. Heterozygote kelΔ/imp-βRE34 Weibchen, ähnlich wie imp-α2D14/imp-βRE34 Fliegen, legen Eier, deren Entwicklung in der frühen Embryogenese angehalten wird. Pull-down Experimente zeigten, dass Kelch und Imp-β physisch interagieren können. Gestützt auf unsere Ergebnisse, schlagen wir ein Modell vor, in welchem Imp-β der Mediator zwischen Imp-α2 und Kelch während der Oogenese ist, und dass Bindung von Imp-α2 an Imp-β Kelch freisetzen kann, das dann in der Lage ist, an RCs zu assozieren. Zusammenfassend kann man sagen, dass diese Untersuchungen einen möglichen Mechanismus aufzeigen, durch welchen Imp-α2 die Lokalisation von Kelch an RCs steuert und Kelch eine neue Rolle während der frühen Embryonalentwicklung zuweist. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit 2D Gelanalysen des Kelch-Proteins, um den Grad der Phosphorylierung im Wildtyp und in imp-α2D14 Ovarien zu untersuchen. Wir konnten einen Anstieg der Phosphorylierung von Kelch in imp-α2D14 Ovarien nachweisen, worauf das Fehlen der nicht-phosphrylierten Isoform hinweist Dieser Befund lässt vermuten, dass die Phosphorylierung von Kelch von Imp-α2 abhängt und schließlich die Lokalisation von Kelch an RCs beeinflusst. Der dritte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Identifizierung eines weiteren, in Wechselwirkung mit imp-α tretenden Proteins, nämlich chickadee (chic). Erste Untersuchungen dieses Gens zeigen, dass eine genetische Interaktion zwischen imp-α2 und chic sowie zwischen imp-β und chic stattfindet. Wir können nachweisen, dass chic eine Rolle in der frühen Embryonalentwicklung spielt, da es an Spindeln und Centrosomen während der mitotischen Teilungen assoziert ist. Weiterhin weist das Ergebnis darauf hin, dass verschiedene Komponenten des Prozesses, die zur RC-Bildung führen, auch während der Mitose aktiv sein können.