English Title: The impact of the Eph/ephrin system on the interaction between leukocytes and vascular cells

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Abstract

Kardiovaskuläre Krankheiten, insbesondere die Arteriosklerose und ihre klinischen Manifestationen wie koronare Herzkrankheiten, Herzinfarkt und Schlaganfall, sind mit ca. 50% die häufigste Todesursache in den westlichen Industrienationen. Arteriosklerose ist eine pathophysiologische Remodellierung der Gefäßwand und die Erforschung der Mechanismen, die zu dieser krankhaften Veränderung beitragen, ist von großer sozioökonomischer Bedeutung. Eine wichtige Rolle bei der Remodellierung der Gefäßwand während der Embryonalentwicklung nimmt das Eph/Ephrin-System ein. Ziel dieser Arbeit war daher die Aufklärung einer möglichen Beteiligung dieses Systems an den pathophysiologischen Remodellierungsprozessen während der Arteriosklerose. Die Analyse der Expression von EphrinB2 im arteriellen Gefäßsystem der Maus zeigte eine Heterogenität im Bezug auf die Menge und Verteilung dieses Moleküls. So war die Expression in den herzfernen Arterien gering, während sie in den großen herznahen Gefäßen wie der Aorta stark erhöht war. Detailanalysen des Aortenbogens zeigten, dass EphrinB2 an den Innenseiten der großen Abgänge besonders stark, an den Außenseiten jedoch nur schwach exprimiert ist. Dieses Expressionsmuster korrelierte mit den Gefäßabschnitten, in denen sich in LDL-Rezeptor- bzw. ApoE-defizienten Mäusen arteriosklerotische Plaques bilden. Genauere Analysen dieser Plaques deuteten darauf hin, dass eine erhöhte endotheliale EphrinB2-Expression mit der Anzahl infiltrierter Monozyten korreliert und weisen insofern auf eine mögliche Beteiligung des Eph/Ephrin-Systems bei der Plaqueentwicklung hin. Darüber hinaus konnte in Monozyten die Expression der EphrinB2-Rezeptoren EphB1-4 nachgewiesen werden, wobei insbesondere EphB2 während der Transdifferenzierung dieser Zellen zu Makrophagen hochreguliert wird. Die Interaktion von Monozyten mit endothelialem EphrinB2 wurde in vitro mit Hilfe der atomic force microscopy (AFM), sowie ex vivo durch Bestimmung der Adhäsion von fluoreszenzfarbstoffmarkierten Monozyten an eine isolierte Aorta bzw. Mesenterialarterie nachgewiesen. Da die Bildung von arteriosklerotischen Plaques nicht nur eine Adhäsion von Monozyten an das Endothel sondern auch eine Infiltration der Monozyten in die Gefäßwand beinhaltet, wurde des Weiteren untersucht, ob die Interaktion von Monozyten mit endothelialem EphrinB2 die Transmigration dieser Zellen verstärkt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass EphrinB2 nicht nur die Migration der Monozyten erhöht sondern auch deren Transmigration durch das Endothel beeinflusst. Zudem führte die Interaktion mit EphrinB2 zu einer pro-inflammatorischen Aktivierung der Monozyten. So wurde u.a. die Expression der Arteriosklerose-assoziierten Chemokine MCP-1 und Interleukin-8 in EphrinB2-stimulierten Monozyten signifikant hochreguliert. Zusätzliche Protein-Arrays zeigten, dass diese Chemokine nach EphrinB2-Stimulation vermehrt von den Monozyten freigesetzt werden. Die Spezifität der Reaktion wurde einerseits durch die Blockade des EphrinB2-abhängigen Signalwegs überprüft, andererseits dadurch, dass dieser EphrinB2-vermittelten pro-inflammatorischen Aktivierung der Monozyten eine Phosphorylierung des Rezeptors EphB2 vorausgeht. Zusammengefasst, unterstreichen diese Daten, dass EphrinB2 bei pathophysiologischen Remodellierungsprozessen der Gefäßwand hochreguliert wird und eine neue Determinante der pro-inflammatorischen Stimulierung von Monozyten darstellt, die zur Pathogenese von Arteriosklerose beitragen kann. Dies stellt eine bisher unbekannte Funktion von EphrinB2 in der kardiovaskulären (Patho-)Physiologie dar, die über die eines arteriellen Markermoleküls hinausgeht.

Translation of abstract (English)

Cardiovascular diseases, arteriosclerosis in particular, are the leading causes of death in the Western world as approximately 50% of the population suffer from these diseases. Arteriosclerosis is a pathophysiological alteration of the vascular wall. Hence, it is of great interest to investigate the mechanisms leading to these pathological alterations. As the Eph/ephrin system is a crucial player of vascular remodelling processes, we hypothesized this system may be involved in the pathomechanism of arteriosclerosis. Therefore, the aim of this study was to elucidate a possible involvement of this system in the pathophysiological remodelling process of arteriosclerosis. Analysis of the distribution of ephrinB2 in the arterial system of the mouse revealed a heterogenous expression pattern of this molecule. The overall expression of ephrinB2 was rather weak with an up-regulation in large conduit arteries like the aorta. Subsequent studies of the aortic arch verified a strong expression at the inner curvatures but a weak expression at the outer curvatures of the bifurcations. This expression pattern coincides with the so-called arteriosclerosis-prone sites in LDL-R- or ApoE-deficient mice, respectively. Detailed analysis of these plaques indicated a correlation between the ephrinB2 expression in the endothelial cells covering the plaque and the number of infiltrated monocytes/macrophages and pointed towards a possible role of the Eph/ephrin system plaque-development. Moreover, monocytes express the receptors for ephrinB2 EphB1-4 with EphB2 being up-regulated upon trans-differentiation into macrophages. By applying atomic force microscopy (AFM), we could demonstrate that monocytes physically interact with ephrinB2. Furthermore, adhesion of these cells to endothelial-intact mouse aortic segments abundantly expressing ephrinB2 was inhibited by pre-treatment with soluble ephrinB2. As the development of arteriosclerotic plaques is not only dependent on the adhesion of monocytes to the endothelium but also on their transmigration into the vascular wall we analyzed if this process is enhanced by ephrinB2. The corresponding analyses confirmed that ephrinB2 not only affects the migration as such but also the transmigration of these cells through the endothelium. In addition, interaction with ephrinB2 led to a pro-inflammatory activation of the monocytes, as evidenced by an increased expression of the arteriosclerosis-related chemokines MCP-1 and Interleukin-8 by these cells. Further protein arrays showed that the release of these chemokines is enhanced as well. The specifity of this reaction was confirmed by blocking the ephrinB2-dependent pathways. Moreover, the monocytic receptor EphB2 was phosphorylated upon interaction with ephrinB2. Taken together, these observations establish ephrinB2 as a molecule that is abundantly expressed at remodelling sites of the arterial tree and as new determinant of the pro-inflammatory stimulation of monocytes and therefore is likely to contribute to the pathogenesis of atherosclerosis. This shows a new function of ephrinB2 in cardiovascular (patho)physiology, which clearly exceeds its role as a mere arterial marker molecule.