English Title: Characterization of DNA demethylation mechanisms for the optimization of epigenetic therapy

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Abstract

Die fehlerhafte Stilllegung von Tumorsuppressorgenen durch Hypermethylierung ihrer Promotorregion ist ein häufig beobachtetes Phänomen in Krebszellen. Die epigenetische Therapie verfolgt das Ziel, die krebsassoziierte Methylierung zu entfernen und auf diese Weise die entarteten Zellen in ihren Normalzustand zurückzuversetzen. Die am weitesten entwickelten demethylierenden Wirkstoffe sind die DNA Methyltransferase-Inhibitoren 5 Azacytidin (Azacytidin) und 5-Aza-2‘-Deoxycytidin (Decitabin). Beide Wirkstoffe wurden für die Behandlung des Myelodysplastischen Syndroms, einer Vorstufe der Leukämie, zugelassen. In welchem Maße neben epigenetischen Effekten auch nicht-epigenetische zytotoxische Effekte den klinischen Erfolg von Azacytidin und Decitabin beeinflussen, ist nicht eindeutig erforscht. Ein genaues Verständnis der Wirkungsweise von Aza¬nukleosiden bildet jedoch die Voraussetzung für eine Optimierung der epigenetischen Therapie. In der vorliegenden Dissertation wurden die zytotoxischen Effekte beider Wirkstoffe in einer epigenetischen Modellzelllinie analysiert und ihre Auswirkungen auf die Demethylierungs-effizienz auf globaler und genspezifischer Ebene charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen eine konzentrationsabhängige DNA-Demethylierung für Azacytidin und Decitabin, wobei Decitabin die DNA schneller und effizienter demethylierte als Azacytidin. Beide Wirkstoffe lösten einen G2-Arrest im Zellzyklus sowie die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen aus. Dabei waren die zytotoxischen Effekte nach Azacytidin-Behandlung stärker als nach Decitabin-Behandlung. Zusätzlich führte die Behandlung mit Azacytidin zu der Einleitung apoptotischer Signalwege. Interessanterweise zeigten die Analysen eine direkte Korrelation zwischen der Stärke der zytotoxischen Nebenwirkungen und der Effizienz der DNA-Demethylierung. Anhand Array-basierter genomweiter Methylierungs¬¬analysen wurde außerdem festgestellt, dass Decitabin etwa 74 % der Gene demethylierte, die auch durch Azacytidin demethyliert wurden. Dabei waren die Wirkstoff-induzierten Demethylierungs-muster reproduzierbar und hochspezifisch. Die präferenzielle Demethylierung von CG-Dinukleotiden außerhalb von CpG-Inseln sowie moderat methylierter CGs, die nicht mit Komponenten des Polycomb-Komplexes PRC2 assoziiert sind, deutet auf eine spezifische und sequenzabhängige DNA-Demethylierung hin. Wirkstoffinduzierte Demethylierungsmuster zeigten außerdem eine große Ähnlichkeit zu Methylierungs-mustern in Zellen mit inaktiviertem DNMT1-Enzym. Interessanterweise führte die gleich-zeitige Inaktivierung von DNMT1 und DNMT3B zu einem synergistischen Effekt, der eine effektive Demethylierung krebsassoziierter Gene begünstigte. Die Ergebnisse dieser Dissertation bilden eine wichtige Grundlage zum Verständnis Wirkstoff-induzierter DNA-Demethylierung und befürworten die Entwicklung spezifischer Hemmstoffe für DNMT1 und DNMT3B zur Optimierung der epigenetischen Krebstherapie.

Translation of abstract (English)

Silencing of tumor suppressor genes by aberrant DNA hypermethylation is a major hallmark of tumor development. Epigenetic therapy aims to reactivate cancer-associated genes by DNA demethylation using DNA methyltransferase inhibitors. The most advanced epigenetic drugs are 5-azacytidine (azacytidine) und 5-aza-2‘-deoxycytidine (decitabine). Both compounds have been approved for the treatment of the myelodysplastic syndrome, a pre-leukemic bone marrow disorder. It is still not clear, to which extent non-epigenetic effects might also contribute to the clinical efficacy of azacytidine and decitabine. Correspondingly, a detailed understanding of the mode of action of azanucleosides will be important to advance the optimization of epigenetic therapy. In the present study, we analyzed cytotoxic effects of both compounds using an epigenetic model cell line and characterized their effects on demethylation efficiency on the global and gene specific level. Our results show concentration-dependent DNA demethylation for azacytidine and decitabine, with decitabine demethylating DNA faster and more efficiently than azacytidine. Both drugs induced cell cycle arrest in G2 phase as well as DNA double strand breaks. However, cytotoxic effects were more severe after azacytidine treatment, which additionally induced apoptotic pathways. Interestingly, our analyses revealed a direct correlation between the extent of cytotoxic side effects and DNA demethylation efficiency. Array-based genome-wide methylation analyses showed that decitabine demethylated about 74 % of the genes demethylated by azacytidine. Importantly, drug-induced demethylation patterns were reproducible and highly specific. Moreover, azanucleosides demethylated CGs not located in CpG-islands more efficiently than those within CpG-islands. Finally, demethylation efficiency was reduced for CG dinucleotides associated with components of the polycomb group complex PRC2. These observations suggest a specific and sequence-context-dependent mechanism of demethylation. Interestingly, drug-induced demethylation patterns were most similar to methylation patterns in DNMT1 knockout cells and differed markedly from cells lacking DNMT3B. Significantly, the knockout of both, DNMT1 and DNMT3B enzymes resulted in a synergistic effect, and induced an efficient and preferential demethylation of cancer-associated genes. Our results provide the foundation for understanding drug-induced DNA demethylation and suggest that the development of specific inhibitors for DNMT1 and DNMT3B will improve the efficacy of epigenetic cancer therapy.