German Title: Vereinfachte STED Mikroskopie

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Abstract

This work discusses rugged technical simplifications for STED nanoscopy and methods related to it (RESOLFT). STED is a type of laser scanning microscopy that uses stimulated emission in order to inhibit spontaneous fluorescence from outer parts of the focal spot. This deliberate transient off-switching of fluorophores permits even densely packed fluorescent molecules to be spatially isolated from the rest; and because isolated molecules can be registered sequentially — no matter how close they are — the resolution is increased beyond the diffraction limit. For switching, STED asks for a separate inhibition beam modified in a way that it suppresses fluorescence, but only in the peripheral regions of the focal spot. The requirements of a second beam path and additional means for beam shaping have kept STED from gaining the currency it deserves, although high resolution is in huge demand, generally. Here, it is discussed how contemporary STED setups can be simplified radically; in fact up to a point where it is possible to upgrade existing laser scanning systems with a co-aligned STED-beam, simply by adding an element about the size of an optical thin-film filter. As the apparent need for a separate beam path ceases to exist, STED becomes simpler and more reliable. At the same time, the performance is the same as for a traditional STED-setup.

Translation of abstract (German)

Die vorliegende Arbeit erörtert Möglichkeiten zur technischen Vereinfachung von STED Nanoskopen und verwandten Verfahren (RESOLFT). STED ist eine Weiterentwicklung traditioneller Laserrastermikroskopie und basiert auf der Unterdrückung von spontaner Fluoreszenz im äußeren Bereich des Anregungs-Beugungsflecks mittels stimulierter Emission. Das gezielte transiente Ausschalten von Farbstoff-Molekülen hat zur Folge, dass Objekte von sehr nahe liegenden anderen Objekten räumlich getrennt werden können; das wiederum ermöglicht sequentielles Auslesen dieser Objekte und damit Auflösungen unterhalb der Beugungsgrenze. Für das Ausschalten wird jedoch ein zweiter Strahl erforderlich, der für die Unterdrückung der Fluoreszenz am Rande des Anregungs-Beugungs- flecks verantwortlich zeichnet. Das erfordert einen unabhängigen Strahlengang, da der STED-Strahl so verändert werden muss, dass er nur am Rand wirkt. Nun ist generell der Bedarf an Systemen mit verbesserter Auflösung sehr groß, allerdings stehen oben genannte Erfordernisse der großflächigen Verbreitung von STED im Wege — bis jetzt. Hier werden nun Möglichkeiten zur radikalen Vereinfachung gegenwärtiger STED-Aufbauten diskutiert. In der Tat wird gezeigt, dass auch bestehende Laserrastermikroskope durch Bereitstellen einer STED-Quelle und den Einbau eines Elements etwa von der Größe eines Dünnschicht- filters zu STED-fähigen Systemen umgerüstet werden können. Weil die Notwendigkeit eines weiteren Strahlengangs entfällt, werden diese Systeme robuster und zuverlässiger, gleichzeitig aber ist ihre Leistungsfähigkeit und die erzielbare Auflösung in keinster Weise vermindert.