German Title: Fluoreszierende Eisenoxid-Nanopartikel für molekulare MR und optischeBildgebung

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Abstract

Der Fokus dieser Arbeit liegt im Design und der Herstellung von Eisenoxyd- Nanopartikeln zur Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie MRT) sowie die optische Bildgebung (OI). Eisenoxyd Kerne der Größe 5-6 nm, mit niedrigem Polydispersitäts-Index wurden durch Kopräzipitations-Strategien unter wässrigen Reaktionsbedingungen hergestellt. Zunächst wurden lanthanid-dotierte Nanopartikel (Ln-USPIO) getestet, welche scheinbar aufgrund von zu geringen Mengen von, in das Eisenkristallgitter inkorporierten, Lanthaniden nicht fluoreszent waren. Dies lässt sich durch die größenbasierenden Unterschiede zwischen Lanthaniden und Eisenkationen erklären, welche die Dotierungseffizienz entscheidend verringern. Als zweites haben wir eine Fluoreszenzummantelung der Nanopartikel durch Naphthalin-Sulfonsäure und deren modifizierter Analoge verwendet, was allerdings (trotz vorhandener Stabilität) ebenfalls erfolglos blieb, da die Partikel nicht fluoreszent waren. Grund war das Quenchings der Fluoreszenz aufgrund von Elektronenübertragung zwischen den aromatischen Naphthalin-Sulfatringen und den Eisenoxyd-Partikeln. Danach erforschten wir adsoptive Coatingsubstanzen, welche nicht quenchen und relativ stabil sind. Erfolgversprechend erwiesen sich Flavinanaloga (Flavinmononukleotid (FMN) und Flavin Adenin Dinukleotid (FAD)). Dies sind relativ simpel strukturierte, endogene Moleküle, die von Krebs- oder metabolisch aktiven Zellen, über den Flavin Rezeptor (RCP) internalisiert werden. Biokompatible, fluoreszierende und nicht-polymere FMN-und FAD-beschichtete USPIO (FLUSPIO und FAD USPIO) konnten als vielseitiges MR-Kontrastmittel entwickelt.Herstellung stabiler flavin adsorbierter Nanopartikel durch Beschallung der USPIO mit FMN/FAD mit anschließender GMP-Beschichtung unter wässrigen Bedingungen. Der Kerndurchmesser, die Oberflächenmorphologie und die Oberflächenbedeckung der FMN- und FAD-ummantelten USPIO (FLUSPIO; FAD USPIO) wurden mittels TEM,DLS, SEM, AFM, Power XRD, EDX und TGA ermittelt. Die magnetischen Eigenschaften der FLUSPIO und FAD USPIO wurden mit Hilfe von MRT und SQUID untersucht. Die Analyse der Fluoreszenzeigenschaften von FLUSPIO and FAD USPIO erfolgte durch Fluoreszenz -Spektroskopie, Mikroskopie und Bildgebung. Zellvitalität und Biokompatibilität der FLUSPIO und FAD-USPIO wurden durch Trypanblau-, 7-AAD- und TUNEL-Färbung ermittelt. Die in vitro-Evaluierung der Labelingeffizienz sowie der Spezifität bezüglich RCP wurde mittels MRT und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Das pharmakokinetische Verhalten von FAD USPIO wurde in CD1 Nacktmäusen nach intravenöser Injektion durch Fluoreszenzspektroskopie gezeigt. Die in vivo Aufnahme der FAD USPIO Nanopartikel wurde in männlichen, subkutane Prostatakarzinome tragenden CD1 Nacktmäusen ermittelt. Die Aufnahme wurde mit der des klinisch verwendeten SPIO Kontrastmittels Resovist verglichen und weiterhin getestet durch Berliner Blau- sowie immunhistologische Färbungen an Tumorschnitten. Die hohe Relaxivität (r2 und r1), sowie das superparamagnetische Verhalten der FLUSPIO / FAD USPIO wurden mittels MRT und SQUID validiert. Die Biokompatibilität der FLUSPIO und FAD USPIO wurde durch verschiedene Zellvitalitätsassays und Färbungen nachgewiesen. Die hohe Effizienz der FLUSPIO / FAD USPIO in Bezug auf die Markierung von Krebszellen (PC-3, DU-145, LnCaP) sowie aktivierter Endothelzellen (HUVEC) und ihre Spezifität für RCP wurde durch MRT, ICP-MS und Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Die in vivo-Aufnahme der FAD USPIO durch experimentell erzeugte Prostatakarzinome war signifikant höher als die Aufnahme des kommerziellen SPIO-Kontrastmittels Resovist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich in unseren Ansätzen magnetischfluoreszente Eisenoxyd-Nanopartikel mit FAD/FMN Beschichtung als am aussichtsreichsten erwiesen. Diese Partikel zeigten eine starke RCP-vermittelte Aufnahme durch Krebs – und aktivierte Endothel-Zellen sowie eine starke Akkumulation innerhalb der Tumoren, nach intravenöser Injektion. Die Möglichkeit des RCP-Targeting könnte demnach ein neuer vielversprechender Weg sein, um Nanopartikel und Arzneimittel in metabolisch aktive Krebszellen einzuschleusen.

Translation of abstract (English)

The thesis focuses on design and development of iron oxide nanoparticle-based dual modal contrast agent for magnetic resonance (MR) and optical imaging (OI). Iron oxide cores of size 5-6 nm with low polydispersity index were generated by co-precipitation under aqueous reaction conditions. Firstly, we tested lanthanide-doped iron oxide nanoparticles (Ln-USPIO), which seemed to exhibit no florescence due to lower levels of lanthanide incorporated into the iron crystal structure, which can be explained by the size-based difference between lanthanide and iron cations, thus, limiting doping efficiency considerably. Secondly, we attempted fluorescence coating of the nanoparticles using naphthalene disulfonic acids and it´s modified analogues, which also proved unsuccessful (although stable) due to quenching (accounted to the prominent electron transfer between aromatic ring of naphthalene sulfonates and iron oxide particles). Thereafter, we explored coating (ligand) molecules, which are essentially non-quenching and relatively stable. To this end, we researched on flavin analogues (flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD))- relatively simple structured molecules, which are endogenous and internalized by highly over-expressed riboflavin carrier protein (RCP) in cancer/metabolically active cells. Based on the advantages exhibited by flavin analogues, biocompatible, fluorescent and non-polymeric FMN- and FAD-decorated USPIO (FLUSPIO and FAD USPIO) were developed as versatile MR contrast agents. Stable flavin adsorbed nanoparticles were generated by sonicating USPIO with FMN/FAD. It was then coated with GMP (guanosine monophosphate) under aqueous conditions. The core diameter, surface morphology and surface coverage of FLUSPIO and FAD USPIO were evaluated using TEM, DLS, SEM,AFM, powder XRD, EDX, and TGA. The magnetic properties of FLUSPIO and FAD USPIO were studied using MRI and SQUID. The fluorescence properties of FLUSPIO and FAD USPIO were analyzed using fluorescence- spectroscopy, microscopy and imaging. Cell viability/biocompatibility of FLUSPIO and FAD USPIO was evaluated using Trypan blue and 7-AAD staining, and TUNEL assay. In vitro evaluation of FLUSPIO/FAD USPIO labeling efficiency and their specificity towards RCP was studied using MRI and fluorescence microscopy. The pharmacokinetic behavior of FAD USPIO was analyzed in CD1 nude mice after its intravenous injection by fluorescence spectroscopy. The in vivo uptake of FAD USPIO nanoparticles was assessed using MRI in CD1 male nude mice bearing subcutaneous prostate tumors (LnCap) and duly compared with Resovist and further tested using Prussian blue staining and immunohistochemistry. The high relaxivities (r2 and r1) and super paramagnetic behavior of FLUSPIOFAD USPIO was confirmed by MRI and SQUID. The biocompatibility of FLUSPIO and FAD USPIO was proven via different cell viability assays and staining. FLUSPIO/FAD USPIO high efficiency in labeling cancer (PC-3, DU-145, LnCap) and activated endothelial (HUVEC) cells and their specificity for RCP was confirmed by MRI, ICP-MS and fluorescence microscopy. The in vivo uptake of FAD USPIO by experimental prostate carcinomas was significantly higher than the uptake of the commercial SPIO contrast agent Resovist. In summary, of our different attempts to generate magnetoflourescent iron oxide nanoparticles for optical and MR imaging, those with FAD/FMN-adsorptive coating were most promising. These particles showed a strong RCP-mediated uptake by cancer- and activated endothelial cells and also strongly accumulated in tumors after intravenous injection. Thus, RCP-targeting may be a new and promising way to transport nanoparticles and drugs into metabolically active cells.