German Title: Zielgerichtete lentivirale Vektoren, pseudotypisiert mit den Glykoproteinen des Tupaia paramyxovirus

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Abstract

Lentiviral vectors (LVs) are vectors of choice for many gene therapy applications since they mediate long term gene expression and can transduce dividing and non-dividing cells. Recently, efficient targeting of LVs pseudotyped with the measles virus (MV) glycoproteins has been reported. However, MV antibodies in patients might limit the clinical use of these vectors. Thus, aim of this study was the development of targeted LVs pseudotyped with the glycoproteins of Tupaia paramyxovirus (TPMV). Since this animal paramyxovirus does not infect humans, no TPMV antibodies in patients are expected. For efficient incorporation in LVs, the TPMV glycoproteins, the hemagglutinin (H) and fusion (F) protein, were modified by truncation of their cytoplasmic tails. Targeting was achieved by displaying a single-chain antibody against the B cell surface marker CD20 on the H protein. The modified proteins were biochemically characterized and tested for their functionality. Unexpectedly, it was observed that an additional proteolytic cleavage of the F protein occurs during activation, resulting in the fragments F1a, F1b and F2. The newly identified fragment F1a was detected in virions and in supernatant of transfected cells. The F1a/F1b cleavage site was mapped and a cysteine protease was identified as likely activating protease. The data indicate that F protein processing is more complex than expected. After characterization, the modified TPMV glycoproteins were screened in all combinations for their ability to form functional pseudotyped LVs. Most efficient pseudotype formation was achieved with CT truncations of 80 amino acids (aa) for H (HΔ80αCD20) and 32 aa for F (FΔ32) (titers ~ 106 t.u./ml). The resulting vectors selectively transduced CD20-positive cells in a mixed cell population. Furthermore, they mediated efficient gene transfer into activated and quiescent primary human B cells. Neutralization assays showed that TPMV-pseudotyped vectors were not neutralized by human sera containing MV antibodies. In conclusion, it was demonstrated that targeted LVs pseudotyped with TPMV glycoproteins can be generated and escape neutralization by MV antibodies. Remarkably, the vectors are able to efficiently transduce even quiescent B cells. Hence, they might be a valuable vector choice when systemic application of targeted lentiviral vectors in humans is required.

Translation of abstract (German)

Lentivirale Vektoren (LV) sind für viele Anwendungen in der Gentherapie besonders gut geeignet, da das eingebrachte Gen über einen langen Zeitraum exprimiert wird und sie mitotisch aktive und inaktive Zellen transduzieren können. Kürzlich wurden zielgerichtete LV entwickelt, welche mit Masernvirus (MV)-Glykoproteinen pseudotypisiert sind. Allerdings würden MV-Antikörper in Patienten die klinische Anwendung dieser Vektoren wahrscheinlich erschweren. Deshalb wurden in dieser Arbeit LV entwickelt, welche mit den Glykoproteinen des Tupaia paramyxovirus (TPMV) pseudotypisiert sind. Da es sich dabei um ein für den Menschen nicht infektiöses Tier-Paramyxovirus handelt, werden keine Antikörper in Patienten gegen dieses Virus erwartet. Für einen effizienten Einbau der TPMV-Glykoproteine in LV, nämlich das Hämagglutintin (H) und Fusionsprotein (F), wurden die zytoplasmatischen Domänen (ZD) der Proteine verkürzt. Zielgerichteter Zelleintritt wurde ermöglicht, indem ein einkettiges Antikörper-Fragment (single chain antibody, scAb) gegen das B-Zell-Oberflächenmolekül CD20 an das H-Protein fusioniert wurde. Die modifizierten Proteine wurden biochemisch charakterisiert und auf ihre Funktionalität geprüft. Dabei wurde ein neues Fragment des F-Proteins detektiert (F1a), das aus einer unerwarteten zusätzlichen Spaltung des F-Proteins stammt und sowohl in Virionen als auch im Überstand transfizierter Zellen nachgewiesen wurde. Die entsprechende Spaltstelle wurde lokalisiert und eine Cystein-Protease als wahrscheinlich aktivierende Protease identifiziert. Die Daten deuten darauf hin, dass die Aktivierung des F-Proteins komplexer ist als ursprünglich gedacht. Die modifizierten Glykoproteine wurden des Weiteren in allen Kombinationen darauf getestet, funktionale pseudotypisierte LV zu bilden. Am effizientesten war eine Verkürzung der ZD von 80 Aminosäuren (AS) für H (HΔ80αCD20) und 32 AS für F (FΔ32) (Titer ~ 106 t.u./ml). Die entsprechenden Vektoren transduzierten selektiv CD20-positive Zellen in einer gemischten Zellpopulation und außerdem aktivierte und ruhende primäre humane B-Zellen. Neutralisations-Experimente zeigten, dass die Vektoren nicht von Humanserum mit MV-Antikörpern neutralisiert werden. Die in dieser Arbeit entwickelten Vektoren ermöglichen gezielten Zelleintritt und transduzieren bemerkenswerter Weise sogar ruhende B-Zellen. Folglich würden sie sich sehr für gentherapeutische Anwendungen in Menschen eignen.