German Title: Charakterisierung des Butyrate response factor 2 und seine Rolle im AU-reichen Element-vermittellen mRNA-Abbau

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Abstract

AU-rich element-mediated mRNA decay (AMD) is a prominent mode of mRNA degradation in the cell considering 10-15 % of mRNA in the cells include an AU-rich element (ARE) in their 3’ UTR. These mRNAs code for proteins involved in important cellular processes, namely, growth and maintenance, development, transcription, inflammation, apoptosis, etc. AMD is majorly promoted by the TTP family of proteins consisting of TTP, BRF1, and BRF2, which bind to the AREs in the 3’UTR of mRNAs and accelerate their degradation. The TTP family members show diverse characteristics inspite of bearing extensive homology amongst each other. In my study, I attempted to characterize the BFR2 protein and determine its possible role in AMD. Experiments in this study suggested that BRF2 degrades mRNA in an ARE-dependent manner and that BRF2 binds to 14-3-3 in a phosphorylation-dependent manner. I studied to greater detail the binding characteristics of BRF2 with 14-3-3 as a possible means of regulation of the AMD activity of BRF2. I could establish that S123 and S257 are the binding sites for 14-3-3 on BRF2 and that mutating both sites together is necessary for abolishing 14-3-3 binding. MK2 kinase seemed to affect phosphorylation of BRF2 and 14-3-3 binding, since 14-3-3 binding appeared reduced when an inactive form of MK2 was co-expressed. However, unlike observed in TTP and BRF1, MK2 did not appear to reduce AMD efficiency of BRF2 in the given experimental conditions. This could possibly indicate that BRF2 might be resistant to inactivation by stress-induced kinases. The 14-3-3 binding mutants showed a slightly more nuclear presence than the BRF2 wildtype which remained predominantly cytoplasmic. On exposure to arsenite stress, a part of the nuclear fraction of the BRF2 wildtype protein seemed to shift to the cytoplasm. All 14-3-3 binding mutants spontaneously localized to P bodies equally efficiently and to arsenite-induced stress granules with slightly varying efficiencies. Preliminary co-immunoprecipitation experiments suggest of interactions between BRF2 and the mRNA deadenylation machinery. BRF2:aa1-275 (N-terminus + RNA binding region) and BRF2:aa97-275 (RNA binding region) were seen to localize to the nucleus. This could be because of lack of the nuclear export signal (NES) from the C terminus. Interestingly, BRF2:aa1-275 shifted to the cytoplasm on exposure to oxidative stress, which could indicate presence of an additional NES in the N-terminus which is active in oxidative stress. It was seen that the central RBD region consisting of the two 14-3-3 sites and two zinc fingers was sufficient to cause AMD of ß-globin-ARE reporter mRNA. BRF2:aa97-275 despite being predominantly nuclear is still capable of promoting AMD, and AMD has hitherto not been shown to take place in the nucleus. This opens up an interesting idea as to whether AMD could actually be nucleus-associated.

Translation of abstract (German)

AU-reiches Element-vermittelter mRNA Abbau (AMD) ist eine bedeutende Form des mRNA Abbaus in der Zelle, da 10-15 % aller mRNAs ein AU-reiches Element (ARE) in ihrer 3’ untranslatierten Region (UTR) beinhalten. Diese mRNAs kodieren für Proteine, die in wichtigen zellulären Prozessen involviert sind, beispielsweise Zellwachstum und -erhaltung, Entwicklung, Transkription, Entzündung oder Apoptose. AMD wird hauptsächlich von Proteinen der Tristetraprolin (TTP) Familie, bestehend aus TTP, BRF1 und BRF2, vermittelt. Diese Proteine binden an AREs in der 3’UTR von mRNAs und beschleunigen dadurch deren Abbau. Proteine der TTP Familie weisen eine beträchtliche Homologie zueinander auf, zeigen aber trotzdem unterschiedliche Charakteristika. In meiner Doktorarbeit habe ich das Protein BRF2 charakterisiert und seine mögliche Funktion in AMD bestimmt. Die Experimente dieser Arbeit deuten darauf hin, dass der mRNA Abbau durch BRF2 abhängig von AREs ist, und dass BRF2 in Abhängigkeit des Phosphorylierungsstatus an 14-3-3 Protein bindet. Die Eigenschaften der Interaktion von BRF2 und 14-3-3 habe ich als eine Form der Regulation der AMD-Aktivität von BRF2 genauer untersucht. Ich konnte zeigen, dass 14-3-3 über die Bindestellen Serin123 und Serin257 an BRF2 bindet, und dass es notwendig ist, beide Serine zu mutieren, um die 14-3-3-Interaktion mit BRF2 zu verhindern. Die Kinase MK2 scheint die Phosphorylierung von BRF2 und damit die Bindung an 14-3-3 zu beeinflussen, da die Interaktion mit 14-3-3 reduziert ist, wenn eine inaktive Form von MK2 co-exprimiert wird. Anders als für TTP und BRF1 scheint MK2 die AMD Effizienz von BRF2 unter den gegebenen experimentellen Bedingungen nicht zu beeinträchtigen. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass BRF2 möglicherweise resistent gegenüber der Inaktivierung durch Stress-induzierte Kinasen ist. Die 14-3-3 Bindungsmutanten zeigen ein leicht verstärkt nukleäres Auftreten verglichen mit dem BRF2 Wildtyp, der vorwiegend zytoplasmatisch verbleibt. Durch Arsenit-Stress verlagert sich ein Teil der nukleären Fraktion des BRF2 Wildtyp Proteins in das Zytoplasma. Alle 14-3-3 Bindungsmutanten lokalisieren spontan und mit gleicher Effizienz in processing bodies und zeigen leicht unterschiedliche Lokalisation in Arsenit-induzierten stress granules. Erste Co-Immunopräzipitation-Experimente weisen auf eine Interaktion zwischen BRF2 und der mRNA Deadenylierungs-Maschinerie hin. Die Fragmente BRF2:aa1-275 (N-Terminus + RNA-Bindungsregion) und BRF2:aa97-275 (RNA Bindungsregion) zeigen beide Kernlokalisation. Ein Grund dafür könnte das fehlende nukleäre Exportsignal (NES) am C-Terminus sein. Interessanterweise verschiebt sich BRF2:aa1-275 ins Zytoplasma unter oxidativem Stress, was ein Hinweis auf ein weiteres NES im N-Terminus sein könnte, welches unter oxidativem Stress aktiv ist. Außerdem konnte ich zeigen, dass die zentrale RNA-Bindedomäne, die aus den zwei 14-3-3 Bindestellen und zwei Zinkfingern besteht, ausreichend ist, um AMD von ß-globin-ARE Reporter mRNAs zu bewirken. Obwohl mBRF2:aa97-275 hauptsächlich nukleär vorkommt, ist die Mutante immer noch fähig, AMD auszulösen. Dies eröffnet das interessante Konzept, dass funktionelles AMD Kern-assoziiert sein könnte, was bislang noch nicht nachgewiesen werden konnte.