English Title: Expression control of ER aminopeptidases in melanoma cells and its influence on CD8+ T cell epitope generation

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Abstract

Melanomzellen, welche hauptsächlich aus einer malignen Transformation Pigment-bildender Zellen der Haut hervorgehen, können durch autologe CD8+ T-Lymphozyten selektiv zerstört werden. Die Selektivität basiert hierbei auf der Interaktion des T-Zellrezeptors (TCR) mit spezifischen Oberflächenkomplexen der Tumorzellen, bestehend aus HLA Klasse I Molekülen und daran gebundenen Antigenpeptiden. Die Antigenpeptide gehen aus der Degradation von Tumorproteinen hervor, die initial durch den Proteasomkomplex übernommen wird. Das Proteasom generiert Peptide unterschiedlicher Länge und definiert dabei den korrekten C-Terminus der Antigenpeptide. Viele Proteasomprodukte sind aber zu lang für die Bindung an HLA Klasse I Moleküle und bedürfen daher der N-terminalen Prozessierung durch Aminopeptidasen. Bisher sind zwei humane ER-lokalisierte Aminopeptidasen bekannt, ERAP1 und ERAP2. ERAP1 ist nachweislich für eine effiziente Generierung viraler und parasitärer Antigenpeptide von Bedeutung. Die Rolle dieser Peptidase in der Prozessierung von Tumor-assoziierten Peptidepitopen ist jedoch bislang unklar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher die Bedeutung von ERAP1 in der Antigenpräsentierung von Melanomzellen untersucht werden. Außerdem sollten Stimuli und Signalwege, welche die ERAP1 und ERAP2 Expression regulieren, bestimmt werden. Um die Rolle von ERAP1 in der Antigenpräsentation von Melanomzellen zu klären, wurde das autologe Tumor-CD8+ T-Zell System des Melanompatienten Ma-Mel-86 verwendet. In den Zelllinien Ma-Mel-86a und Ma-Mel-86c, etabliert aus verschiedenen Metastasen dieses Patienten, wurde die ERAP1 Expression mittels shRNA stabil herabreguliert. Die Herabregulation von ERAP1 zeigte keinen Einfluss auf die Menge der HLA Klasse I Moleküle an der Zelloberfläche. Um den Einfluss der verminderten ERAP1 Expression auf die CD8+ T-Zellerkennung der Tumorzellen zu bestimmen, wurden aus dem peripheren Blut stammende autologe CD8+ T-Zellen zunächst mehrmals mit Ma-Mel-86a Zellen stimuliert. Anschließend wurde die Fähigkeit dieser “bulk“ CD8+ T-Zellen, Ma-Mel-86a im Vergleich zu ERAP1 shRNA transfizierten Ma-Mel-86a Melanomzellen zu erkennen, analysiert. Interessanterweise beeinträchtigte die ERAP1 Herabregulation die Erkennung der Ma-Mel-86a Melanomzellen durch die autologen “bulk“ CD8+ T-Lymphozyten, was darauf hindeutet, dass die Reduktion der ERAP1 Aktivität zu einer Veränderung im Antigen-Epitoprepertoire der HLA Klasse I Moleküle führte. Die verminderte ERAP1 Expression reduzierte auch die Erkennung der Tumorzellen durch einen autologen CD8+ T-Zellklon, der ein mutiertes Zielantigen erkannte. Vergleichbare Beobachtungen wurden ebenfalls für Ma-Mel-86c ERAP1 shRNA Transfektanten gemacht, die eine verringerte Stimulationskapazität gegenüber zwei von drei autologen CD8+ T-Zellklonen unterschiedlicher Spezifität zeigten. Aufgrund der Bedeutung von ERAP1 in der Epitoppräsentierung von Melanomzellen wurde nachfolgend das Expressionsprofil von ERAP1 und ERAP2 in verschiedenen Zelllinien sowie die Regulation der ERAP Expressionen analysiert. Zunächst konnten starke Unterschiede in der ERAP1 und ERAP2 Expression zwischen Zelllinien, etabliert aus verschieden Metastasen der Melanompatienten, festgestellt werden. Da derzeit die immunmodulierenden Eigenschaften von Chemotherapeutika intensiv untersucht werden, galt es, deren Einfluss auf die ERAP1 und ERAP2 Expression zu bestimmen. Interessanterweise führte die Behandlung verschiedener Zelllinien mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin zu einer erhöhten Promotoraktivität sowie zu einer verstärkten mRNA Expression beider Aminopeptidasen, wobei sich die Modulation der ERAP1 Expression abhängig vom p53 Status der Zellen zeigte. Diese Induktionen waren jedoch auf Proteinebene nur teilweise zu erkennen, was zusätzlich auf eine post-transkriptionelle Regulation der ERAP1 und ERAP2 Expression hindeutet. Die Resultate dieser Arbeit belegen, dass ERAP1 eine wichtige Rolle im Prozess der Generierung von Tumor-assoziierten CD8+ T-Zell Epitopen in Melanomzellen übernimmt. Somit ist davon auszugehen, dass eine heterogene ERAP Expression in Metastasen von Tumorpatienten mit quantitativen und/oder qualitativen Veränderungen im antigenen HLA Klasse I Peptid-Repertoire verbunden ist. Dieser Effekt könnte die Effizienz Epitop-spezifischer Tumortherapien, wie den adoptiven Transfer TCR-transgener CD8+ T-Zellen, beeinflussen und sollte daher bei der Erstellung der Therapie berücksichtigt werden.

Translation of abstract (English)

Melanoma cells that primarily arise from a malignant transformation of pigment-producing cells of the skin, can be selectively destroyed by autologous CD8+ T lymphocytes. The selectivity is provided by the interaction between the T cell receptor (TCR) and specific tumor cell surface complexes, consisting of antigenic peptides bound to HLA class I molecules. The antigenic peptides originate from the degradation of tumor proteins. In general, the multi-catalytic proteasome complex initiates the cleavage of tumor antigens into peptide fragments of different length, thereby defining the C-terminus for the majority of peptides presented by HLA class I molecules. While some of the proteasome products are of the correct size for direct HLA class I binding others are N-terminally elongated peptide precursors that require further trimming by aminopeptidases. Currently two human ER-localized aminopeptidases are known, ERAP1 and ERAP2. While ERAP1 is known to be of specific relevance for the efficient generation of viral and parasitic antigenic peptides, the importance of the peptidase in processing tumor-associated peptide epitopes has not been determined. Thus, the aim of this thesis was to determine the role of ERAP1 in antigen presentation by melanoma cells. Furthermore stimuli and signaling pathways that regulate ERAP1 and ERAP2 expression should be defined. To analyze the impact of ERAP1 on antigen presentation of melanoma cells, the autologous tumor-CD8+ T cell system of melanoma patient Ma-Mel-86 was selected. In the cell line Ma-Mel-86a and Ma-Mel-86c, established from different metastasis of this patient, ERAP1 expression was stably downregulated by shRNA. Importantly, ERAP1 knockdown did not influence the overall of HLA class I surface expression level. To determine the effect of reduced ERAP1 expression in tumor cells on antigen presentation, autologous CD8+ T cells derived from peripheral blood were initially stimulated for several times with Ma-Mel-86a cells. Subsequently, the bulk CD8+ T cells were analyzed for their capability to recognize Ma-Mel-86a in comparison to ERAP1 shRNA transfected Ma-Mel-86a melanoma cells. Interestingly ERAP1 downregulation impaired the recognition of Ma-Mel-86a melanoma cells by autologous bulk CD8+ T lymphocytes, suggesting that reduced ERAP1 activity led to an alteration of the antigenic epitope repertoire presented by HLA class I molecules. Diminished ERAP1 expression also decreased the recognition of the tumor cells by an autologous CD8+ T cell clone recognizing a mutated target antigen. Comparable observations were made for Ma-Mel-86c ERAP1 shRNA transfectants, which exhibited reduced stimulatory capacity towards two of three autologous CD8+ T cell clones of different specificity. Due to the important role of ERAP1 in epitope presentation by melanoma cells the expression profile of ERAP1 and ERAP2 as well as their regulation in several cell lines was analyzed. Firstly, strong distinctions in ERAP1 and ERAP2 expression could be detected between cell lines established from different metastasis of melanoma patients. Since chemotherapeutic drugs, like Doxorubicin, are currently under intense investigation for their immune modulating properties its impact on ERAP1 and ERAP2 expression was determined. Interestingly, the treatment of several cell lines with Doxorubicin led to an increase in promoter activity as well as mRNA expression of both aminopeptidases, with ERAP1 expression being dependent of the p53 status of the cells. However the elevated expression was only partially detectable on the protein level, pointing towards additional post-transcriptional regulation of ERAP1 and ERAP2 expression. The results of this thesis demonstrate that ERAP1 plays an important role in the generation of tumor-associated CD8+ T cell epitopes in melanoma cells. Thus a heterogeneous ERAP expression as it can be detected in metastasis of tumor patients might be associated with quantitative and qualitative alterations in the antigenic HLA class I peptide repertoire. This effect could influence the efficiency of epitop-specific tumor therapies such as the adoptive transfer of TCR-transgenic CD8+ T cells and should be taken into consideration for therapy design.