English Title: AAV9-Calsarcin-1 gentherapy in the treatment of cardial remodelling

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Abstract

Die Ursache für die Entwicklung einer Myokardhypertrophie ist häufig auf eine anhaltende biomechanische Belastung des Herzens (z.B. durch Bluthochdruck) zurückzuführen. Bei der Vermittlung einer pathologischen Hypertrophie spielt dabei die Calcium/Calmodulinabhängige Serin-Threonin-Phosphatase Calcineurin eine zentrale Rolle. Frey et al. (2004) zeigten, dass Mäuse mit einem genetischen Knockout für Calsarcin-1 (CS1-KO), einem Calcineurin-interagierenden Protein, für eben diesen Signalweg sensibilisiert sind. Eine Überexpression von CS1 in transgenen Mäusen hingegen führt bei einer chronischen Infusion von Angiotensin II (Ang-II) nicht zu einer signifikanten Ausbildung einer kardialen Hypertrophie. Um diesen potentiell schützenden Effekt von CS1 in einer kardialen Gentherapie in vivo zu nutzen, wurde ein adeno-assoziierter viraler Vektor (AAV) vom Serotyp 9 (AAV9) generiert, der die kodierende murine CS1-Sequenz unter der Kontrolle eines Cytomegalovirusverstärkten verkürzten Myosinleichtkettenpromotors (CMVenh-MLC0.26) exprimiert. Dieser und ein entsprechender Kontrollvektor, der eine Renilla-Luciferase exprimiert (AAV9-Ren) wurde dann in acht Wochen alte C57BL/6-Wildtyp (WT)- bzw. CS1-KO-Mäuse systemisch über die Schwanzvene mit einer viralen Dosis von 2x1011 und 1x1012 vG/Tier injiziert. Anschließend wurden die Mäuse durch osmotische Minipumpen für zwei Wochen einer chronischen Ang-II- (1000 ng/kg Körpergewicht pro min) bzw. 0,9%NaCl-Infusion ausgesetzt. AAV9-Ren kontrollbehandelte WT- und CS1-KO-Mäuse zeigen unter Ang-II-Infusion eine kontraktile Dysfunktion mit einer signifikanten Reduktion der fraktionellen Verkürzung, eine Dilatation des linken Ventrikels sowie eine signifikante Zunahme im Herzgewicht-Körpergewicht-Verhältnis. In WT-Mäusen führte die AAV9-basierte CS1-Überexpression zu einer signifikanten Abschwächung der linksventrikulären Dysfunktion und Fibrose sowie zur Reduktion des durch Angiotensin II-induzierten hypertrophen Genprogramms (ANF, BNP, β-MHC). In CS1-KO-Mäusen konnte hingegen durch die Reexpression von CS1 lediglich eine Verbesserung der Fibrose (Reduktion der Kollagen III-mRNA-Expression) erreicht werden. Schlussfolgernd konnte das erste Mal gezeigt werden, dass eine AAV9-basierte Expression von CS1 in vivo möglich ist. Die jedoch nur sehr moderate Expressionsrate (10%) von CS1 im Vergleich zum WT muss jedoch für eine erfolgreiche gentherapeutische Anwendung, z.B. durch den Einsatz von alternativen und kardialspezifischeren Promotoren weiter gesteigert werden. Ebenso sind weitere Analysen in anderen Hypertrophiemodellen notwendig, um das Potential einer CS1-Gentherapie umfassend zu evaluieren.

Translation of abstract (English)

Cardiac remodelling caused by sustained pressure and/or volume overload leads to the development of cardiac hypertrophy. One important molecular pathway involved in hypertrophic growth is mediated by the calcium- and calmodulin dependent serine-threonine phosphatase calcineurin, which plays a key role in transducing calcium-dependent signals from the cytosol to the nucleus. In previous studies Frey et al. (2004) showed that mice lacking Calsarcin-1 (CS1-KO), a calcineurin-interacting protein, are sensitized to calcineurin signaling. Conversely, mice overexpressing CS1 revealed blunted hypertrophic growth when exposed to chronic angiotensin II-infusion. To use the protective effect of CS1, we generated an adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) containing the CS1 full length coding sequence under the control of the 0.26kb cardiac myosin light chain promoter fused to the cytomegalovirus immediate-early enhancer (CMVenh-MLC0.26). AAV9-CS1 or a Renilla-luciferase control-AAV9 (AAV9-Ren) where systemically injected via the tail vain (dose 2x1011 and 2x1012 vg/animal, respectively) in 8-weeks-old male C57BL/6 wild type (WT) and CS1-KO mice. After intravenous AAV9 injection mice were subjected to long-term stimulation with angiotensin II (1000 ng/kg bodyweight per min) or 0.9% NaCl respectively using subcutaneous minipumps for two weeks. Angiotensin II-stimulated and AAV9-Ren treated WT and CS1-KO mice showed a contractile dysfunction with a significant reduction of the fractional shortening (FS) and a dilation of the left ventricle (assessed by echocardiography) as well as an increase in heart weight/body weight ratio. In WT mice the AAV9-mediated overexpression of CS1 significantly attenuated LV-dysfunction, fibrosis and blunted the induction of the typical hypertrophic gene program (ANF, BNP, β-MHC). However, in CS1-KO mice the (low level) re-expression of CS1 only causes an improvement in fibrosis as measured by collagen III mRNA-expression. The hypertrophic gene program as well as the LV-dysfunction could not be ameliorated. In conclusion, this is the first report of an AAV-based expression of CS1 in vivo with a moderate expression level of about 10% compared to WT. However, for a successful application in gene therapy, this low expression level has to be enhanced e.g. by the use of an alternative and more cardiac specific promoter. In addition, further analyses in other models of cardiac hypertrophy are necessary to estimate the potential role of CS1 as a tool for cardiac gene therapy.