German Title: Messung und Korrektur von Aberrationen in Licht- und Elektronenmikroskopie

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Abstract

Imperfections in image formation, called aberrations, often preclude microscopes from reaching diffraction-limited resolution. Aberrations can be caused either by the microscope itself or by the sample and can be compensated for by using an active element integrated into the beam path which is functioning as a corrector. The optimal settings for this corrector need to be determined without excessive damage to the sample. In particular, for sensitive biological samples, the potential gain for signal and/or resolution needs to be weighed against sample damage. Here I present the development of a special type of optical coherence microscopy (called deep-OCM), which allows the precise determination of the average rat brain refractive index in vivo. The conclusion is that two-photon microscopy is affected by optical aberrations in this sample starting at depths around 200 micrometers. Deep-OCM is well suited for imaging myelinated nerve fibers. Individual fibers can be visualized in the living brain in unprecedented depths beyond 300 micrometers. In the second part of this thesis I describe the development and testing of an auto-focuser and auto-stigmator (called MAPFoSt) for a scanning electron microscope to ensure optimal imaging quality after switching samples or during long acquisition series. MAPFoSt determines the three focus and stigmation parameters from only two test images.

Translation of abstract (German)

Abbildungsfehler, so genannte Aberrationen, verhindern in der Mikroskopie häufig das Erreichen einer beugungsbegrenzten Auflösung. Aberrationen können durch Unzulänglichkeiten im Mikroskop verursacht sein, oder andererseits durch die Probe selbst. Zur Korrektur wird ein aktives Element in den Strahlengang integriert. Insbesondere für empfindliche biologische Proben müssen jedoch die Parameter des Korrektors bestimmt werden, ohne die Probe zu sehr in Mitleidenschaft zu ziehen; daher muss der mögliche Gewinn an Signalstärke und/oder Auflösung gegen die Schädigung der Probe abgewägt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit beschreibe ich die Entwicklung einer speziellen Form der optischen Kohärenzmikroskopie (genannt deep-OCM), die die exakte Bestimmung des mittleren Brechungsindex des lebenden Rattenhirns erlaubt. Daraus ergab sich, dass die Zwei-Photonen-Mikroskopie für diese Probe spätestens ab 200 Mikrometer Tiefe durch optische Aberrationen limitiert ist. Deep-OCM eignet sich zur Abbildung von myelinisierten Nervenfasern. Einzelne Fasern können im lebenden Gehirn in bisher unerreichbarer Tiefe von über 300 Mikrometer dargestellt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit präsentiere ich die Entwicklung und Charakterisierung eines Autofokus und Autostigmators (genannt MAPFoSt) für ein Rasterelektronenmikroskop, der nach Probenwechsel oder bei langen Aufnahmeserien die optimale Abbildungsqualität sicherstellt. MAPFoSt ermöglicht es, mit nur zwei Testbildern die drei Fokus- und Stigmationsparameter zu bestimmen.