English Title: Transport Processes and Molecular Interactions : Studies of biological systems using single-molecule fluorescence methods

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Abstract

Durch die Entschlüsselung des menschlichen Genoms wurde eine Fülle detaillierter Bauanleitungen von Proteinen - den Grundbausteinen des Lebens - bekannt. Um dynamische Prozesse, wie Transportvorgänge und molekulare Wechselwirkungen, in lebenden Zellen zu untersuchen, muss aber auf andere Techniken als die der klassischen Biochemie zurückgegriffen werden. In jüngerer Zeit haben sich hierbei vor allem Methoden der Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie als wegweisend herausgestellt. Ein wichtiger Transportmechanismus in Zellen ist die Diffusion, die durch Größe, Form, Ladung und durch die hohe Konzentration der beteiligten Proteine beeinflusst wird. Zum besseren Verständnis dieser Einflüsse wurde in dieser Arbeit die Diffusion von Proteinen bei physiologischen Proteinkonzentrationen mit Hilfe der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie untersucht. Der Vergleich der gemessenen Diffusionskoeffizienten mit Simulationen legt nahe, dass spezifische Proteinstrukturen für abweichendes Verhalten unterschiedlicher Proteinlösungen ausschlaggebend sind. Diese Arbeit liefert Ansätze für eine systematische Studie der beteiligten Parameter zum besseren Verständnis der molekularen Wechselwirkungen in lebenden Zellen. Neben der Diffusion von Proteinen im Zytoplasma wurde auch die Mobilität von Membranproteinen, die für die zelluläre Reaktion auf äußere Einflüsse wichtig sind, in Pflanzenzellen untersucht. Die gemessenen Diffusionskoeffizienten des Kalium-Kanals KAT1 können durch die Existenz von Mikrodomänen erklärt werden. Die Beweglichkeit in der Plasmamembran lässt sich mit Lipiden vergleichen. Außerdem wurde eine neue Methode zur Charakterisierung der Proteinhülle von Transportvesikeln entwickelt, die, im Gegensatz zum stochastischen Markierungsansatz über Immunogoldpartikel, die auftretenden Isoformen spektral unterscheiden kann. Zur Analyse der Zusammensetzung wurde eine Kolokalisationsanalyse mit alternierender Laseranregung kombiniert. Dieser Methodenansatz liefert damit einen neuen Anstoß zur quantitativen Untersuchung der Proteinbeladung von Vesikeln.

Translation of abstract (English)

A vast amount of detailed building instructions for proteins - the basic modules of life - have been discovered by sequencing of the human genome. Nevertheless, one has to use approaches different from those of classical biochemistry to gain information on dynamic processes in living cells, e.g. transport processes and molecular interactions. Single-molecule spectroscopy methods have recently shown the ability to answer questions in this field. Diffusion is one of the most important mechanisms of transport in cells. Parameters such as size, shape, charge and high concentrations of macromolecules affect diffusion. To further understand these influences, the diffusional behavior of several proteins was measured at physiological protein concentrations using fluorescence correlation spectroscopy. A comparison of the measured diffusion-times with simulations leads to the assumption that the specific shape of the proteins is crucial for diffusion in crowded solutions. This thesis provides an approach to systematically study the parameters that influence molecular interactions in living cells. In addition to studying diffusion in the cytoplasm, I investigated the mobility of membraneproteins. This class of proteins is important for the mediation of cellular responses upon external stimuli. The diffusion coefficients that I measured for the potassium channel KAT1 can be explained by the occurrence of microdomains and are in the range of lipid mobility. Furthermore, a new method that enables the characterization of the protein-coat of transport vesicles was developed. In contrast to stochastic labelling methods, e.g. immunogold labeling, it is now possible to spectrally distinguish different isoforms. A combination of alternating laser excitation with colocalization analysis provides the opportunity to quantitatively analyze the protein-composition in the coat of vesicles.