German Title: Molekulare Grundlagen der "Lipid Raft"-Rekrutierung von NK-Zell-Rezeptoren und Entwicklung eines Sialinsäure-basierten Siglec-7-Inhibitors

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Abstract

The activation status of natural killer (NK) cells is determined by the integration of activating and inhibitory signals at the immunological synapse between the NK cell and a target cell. In this work we studied the activating and inhibitory signals of NK cells: The presence of cholesterol-rich membrane domains at the activating immunological synapse and the absence of these membrane domains at inhibitory immunological synapses has supported the role of lipid rafts in the regulation of NK cell activation. Several activating NK cell receptors are known to localize into these lipid rafts upon ligation and thereby influence the functional outcome of a NK cell-target cell contact. How these receptors are recruited into these important membrane domains remains unknown though. In order to elucidate the molecular basis of these mechanisms we studied the structural requirements of the human activating NK cell receptors 2B4 and NKG2D for receptor recruitment into detergent-resistant membrane (DRM) fractions as a model for lipid raft association. Structural requirements in 2B4 for DRM recruitment could be identified at the luminal side of the transmembrane domain and in the CxC motif near the cytoplasmic side of the transmembrane domain. Similar to 2B4, we could determine a requirement for the NKG2D transmembrane domain for DRM recruitment. However, DRM recruitment of both receptors was independent from signal transduction. Thus our study presents data about potential molecular mechanisms involved in lipid raft recruitment. In order to study NK cell inhibition, we developed inhibitors against the sialic acidbinding receptor Siglec-7 on NK cells. This receptor is known to exert inhibitory effects on the function of NK cells and is harnessed by certain pathogens and malignancies for immune evasion. The inhibitors were designed by collaborating biochemists based on the structure of unmodified sialic acid. We screened a broad collection of inhibitors and tested these in functional assays for their capacity to block Siglec-7 receptor-ligand interaction and their effect on NK cell activity. In conclusion, this collaborative study was able to generate the first inhibitor with high affinity against Siglec-7 and with a functional effect on the cytotoxicity of NK cells.

Translation of abstract (German)

Die Aktivierung von natürlichen Killer (NK)-Zellen resultiert aus der Integration von aktivierenden und inhibierenden Signalen an der immunologischen Synapse zwischen einer NK-Zelle und einer Zielzelle. Diese Arbeit behandelt diese aktivierenden sowie inhibierenden Signale in NK-Zellen: Durch die Präsenz von Cholesterin-reichen Membrandomänen in aktivierenden Synapsen und die Abwesenheit dieser Membrandomänen in inhibierenden Synapsen wurde die Rolle von „Lipid Rafts“ in der Regulation der NK-Zellaktivierung gestärkt. Im Falle mehrerer aktivierender NK-Zell-Rezeptoren wurde eine Rekrutierung in diese Membrandomänen nach Zielzell-Bindung festgestellt was den funktionellen Ausgang solch eines Zellkontaktes maßgeblich beeinflussen kann. Wie diese Rezeptoren allerdings in die Membrandomänen rekrutiert werden ist bislang nicht bekannt. Um die molekularen Mechanismen für diese Rekrutierung aufzudecken haben wir die strukturellen Voraussetzungen für die Rekrutierung der NK-Zell-Rezeptoren 2B4 und NKG2D in Detergenz-resistente Membranen (DRM) als Model für die „Lipid Raft“-Rekrutierung untersucht. Strukturelle Voraussetzung in 2B4 für die DRM-Rekrutierung lagen an der luminalen Seite der Transmembrandomäne, sowie in einem CxC-Motiv an der zytoplasmatischen Seite der Transmembrandomäne. Auch NKG2D war strukturell für eine DRM-Rekrutierung auf die Transmembrandomäne angewiesen. Eine Signaltransduktion war jedoch bei beiden Rezeptoren nicht involviert. Diese Studie weist damit strukturelle Voraussetzungen und potenzielle Mechanismen für die „Lipid Raft“-Rekrutierung von Rezeptoren auf. Um die NK-Zell Inhibition zu untersuchen wurden Inhibitoren gegen den Sialinsäurebindenden Rezeptor Siglec-7 entwickelt. Dieser Rezeptor kann die Zellaktivierung von NK-Zellen hemmen und wird durch diverse Pathogene und in verschiedenen Krankheiten als Immunevasionsmechanismus missbraucht. Auf der Grundlage von unmodifizierter Sialinsäure wurde eine Kollektion von Inhibitoren von kollaborierenden Biochemikern entwickelt und von uns in funktionellen Assays auf die Fähigkeit die Rezeptor-Ligandenbindung zu blockieren sowie die NK-Zellaktivität zu beeinflussen getestet. In dieser gemeinschaftlichen Studie wurde der erste hochaffine Siglec-7-Inhibitor mit Einfluss auf die NK-Zellfunktion entwickelt.