German Title: Entschlüsselung des Zusammenspiels zwischen exo-erythrozytären Plasmodium berghei Parasiten und der hepatischen miRNA Expression des Wirtes

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Abstract

Die verschiedenen Schritte während des Lebenszyklus des Malaria Parasiten bedürfen einer sehr engen Interaktion zwischen dem Parasit und dem betroffenen Gewebe des Wirts. Um das enorme Wachstum und die anschließende Differenzierung in invasive Stadien während der klinisch unauffälligen Leberstadienentwicklung gewährleisten zu können, rekrutiert der Parasit Proteine der Wirtszelle. In mehreren Studien wurden genetisch veränderte Parasiten verwendet, denen genau definierte Lebergene fehlten, um diese enge Interaktion zwischen Parasit und Wirtsleberzelle zu untersuchen. So konnte man die Abhängigkeit des Parasiten von Wirtszellfaktoren für eine erfolgreiche Leberstadienentwicklung zeigen. Außerdem waren diese genetisch veränderten Parasiten in der Lage, Immunität in dem entsprechenden Wirt zu induzieren. MicroRNAs (miRNAs) und die RNAi Maschinerie gewinnen zunehmend an Bedeutung für das Zusammenspiel von Pathogen und Wirt. Ursprünglich als Verteidigungsmechanismus des Wirts gegen Pathogene entdeckt, wurde nach und nach gezeigt, dass Pathogene in der Lage sind, die RNAi Maschinerie des Wirts für ihre eigenen Zwecke zu missbrauchen. Darüber hinaus gewinnen auch miRNAs zunehmend an Bedeutung für die Feinabstimmung sowohl bei der Auslösung von verschiedenen Erkrankungen, als auch bei ihrer Bekämpfung. Basierend auf diesen Erkenntnissen konzentrieren sich aktuelle Forschungen auf die Untersuchung des Einflusses, den eine bestehende Infektion mit Plasmodium oder Toxoplasma auf die RNAi Maschinerie und die miRNA Expression des betroffenen Wirtsgewebes hat. Das Ziel der vorliegenden Studie war das Zusammenspiel zwischen Malaria Leberstadien und der RNAi Maschinerie und miRNA Expression in der Wirtsleber im Allgemeinen zu untersuchen. Außerdem sollten die Mechanismen der durch die Immunisierung mit genetisch attenuierten (GAP) und bestrahlungsattenuierten (RAS) Parasiten hervorgerufenen Immunität analysiert werden. Dazu wurden auf der einen Seite mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) die Transkriptionslevel von Xpo-5, Ago-2, Dicer, TRBP and Drosha in murinem Lebergewebe 24 Std. und 40 Std. nach Infektion mit PbNK65 WT, GAP und RAS Speicheldrüsen Sprozoiten bestimmt und mit den Transkriptionsleveln aus naiven Mäusen verglichen. Auf der anderen Seite wurde mit den selben Proben die hepatische Expression von miRNAs untersucht, um in ihrer Expression durch das Vorhandensein von Leberstadien der unterschiedlichen angewandten Stämme beeinflusste miRNAs der Wirtsleber zu identifizieren. Ich konnte eine Herunterregulierung der Transkription aller fünf untersuchten Komponenten feststellen, welche 40 Std. nach Infektion mit den attenuierten Parasiten besonders stark ausgeprägt war. Zusätzliche Western Blot Analysen wurden durchgeführt und bestätigten die Ergebnisse der qPCR Analyse für Xpo-5 und Drosha auch auf Proteinebene. Weiter wurden insgesamt 31 unterschiedlich regulierte hepatische Wirts miRNAs entdeckt, die für jede der verwendeten Probengruppen ein spezielles Expressionsprofil aufwiesen, welches nicht nur die einzigartigen Eigenschaften der verschiedenen eingesetzten Stämme widerspiegelte, sondern auch die zuvor beobachteten Veränderungen in den Transkriptionsraten der RNAi Maschinerie Komponenten. Zwei interessante miRNAs, miR-21 und miR-155, wurden hinsichtlich einer möglichen biologischen Funktion genauer untersucht. Nachdem durch ex vivo Bildgebung gezeigt werden konnte, dass beide miRNAs tatsächlich in infiziertem Lebergewebe überexpremiert werden, wurde ihre Beteiligung am Hervorrufen von Immunantworten durch Immunisierung mit GAP und RAS untersucht. Dazu wurden beide miRNAs unabhängig von einander in vivo in der Mausleber herunterreguliert und dann das Potenzial von GAP und RAS Immunisierungen beobachtet. Diese Experimente zeigten, dass miR-21 und miR-155 an der durch GAP Immunisierung hervorgerufenen Immunität beteiligt sind.

Translation of abstract (English)

The different life cycle stages of the malaria parasite Plasmodium depend on tight interactions between the parasite and the respective host tissue. During the clinically silent liver-phase, the parasite undergoes enormous multiplication and thus requires host hepatic proteins for its growth and development. Several studies using genetically modified parasites lacking defined liver-stage specific genes, proved the tight interaction between parasite proteins and host hepatic factors and the dependency of the parasite on these host factors for completion of its liver-stage development. These parasites were furthermore able to induce specific host immune responses. MicroRNAs (miRNAs) and the RNAi machinery gain more and more importance in the interplay between pathogens and hosts. Initially discovered as defense mechanisms of the host against pathogens, growing evidence proves the abuse of the host RNAi machinery by the pathogen for its own benefit. Additionally, miRNAs gain increasing importance as fine-tuning molecular triggers in causing but also in defense against a very diverse set of diseases. Thus, interest arose in investigating the influence persisting infections with Plasmodium and Toxoplasma might have on the miRNA expression pattern of the respective affected host tissue. The aim of this study was to understand the interplay between the malaria liver-stage and the host hepatic RNAi machinery and miRNA expression in general and to shed some light onto the mechanisms underlying host immunity induced by immunization with genetically attenuated (GAP) as well as radiation-attenuated (RAS) parasites. For this purpose I used a two-fold approach. On the one hand I analyzed by quantitative real-time PCR (qPCR) Xpo-5, Ago-2, Dicer, TRBP and Drosha transcription levels in murine hepatic tissue 24h and 40h after infection with PbNK65 WT, GAP and RAS salivary gland sporozoites and compared them to respective transcription levels in naïve mice. On the other hand I investigated the host hepatic miRNA expression using the same sample pool to detect host hepatic miRNAs that are differentially expressed upon Plasmodium liver-stage infection. I could demonstrate a transcriptional down-regulation of all five host RNAi machinery components investigated, which was more pronounced in livers 40h post infection with both attenuated parasites. Additional Western blot analyses were performed and proved the results from the qPCR analysis for Xpo-5 and Drosha on protein level. Furthermore, a total number of 31 dys-regulated host miRNAs was observed with distinct expression patterns for each of the sample groups, reflecting the unique features of the different parasite strains applied as well as the results of the preceding analyses of host hepatic RNAi machinery components. Two interesting candidate miRNAs, miR-21 and miR-155, were chosen for further functional analysis. After confirming over-expression of these two candidate miRNAs in infected murine hepatic tissue by ex vivo imaging, their impact on induction of protection upon GAP and RAS immunization was analyzed by down-regulation of these two miRNAs in vivo. These experiments indicated that the observed expressional up-regulation of both of both miRNAs might play a supportive role in GAP-induced immunity.