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Abstract

Mutations in genes of various intermediate filament (IF) proteins are the causes of a wide range of diseases. For example, a premature aging disorder, Hutchinson-Gilbert progeria syndrome, is caused by mutation in the nuclear lamins. Mutations in a muscle-specific IF protein desmin cause a wide range of myofibrillar myopathies, and in severe cases cardiomyopathies. The effects of the desmin mutations vary with respect to the severity of their impact on its filament formation capacity. One of the observations on the tissue sections of the patients includes the occurrence of both apparently normal association of desmin filaments with Z-discs as well as the occurrence of desmin accumulations in the muscle cells of patients. However, the exact mechanisms leading to such phenotype remain unknown. The purpose of this PhD thesis was to analyse the effects of some of the known desmin mutations on cell differentiation. In addition, considering what appears to be concurrent occurrence of desmin aggregation and IFs formation as indicated above we aimed to determine to what extent are normal and mutant desmin proteins segregated in these cells. For that purpose, we have employed C2C12 murine myoblast cell line for analyses of the impacts of desmin mutantions. As these cells can be induced to differentiate they are commonly used as a model in studies on muscle cells. Therefore, we have transfected genes of the normal human desmin (hDesWT) and some known desmin mutants into these cells. In order to detect the transfected protein antibodies specific for hDes were generated. Two desmin gene mutations were used for the analyses, namely hDesE245D and hDesR350P. Whereas the former desmin mutant was found to be incorporated into the IF-system of fibroblasts, the later segregates from it and accumulates in small aggregates through the cell. The analyses performed included cell fractionation and immuno-cytochemistry. hDesWT and hDesE245D mutant were predominantly found to incorporate into endogenous desmin IFs, whereas the extent of hDesR350P mutant incorporation into the filaments varied in the cell population. By subsequent cell passaging the number of hDesR350P-expressing cells was reduced, whereas both hDesWT and hDesE245D were still expressed to a similar extent. Subsequently transfected C2C12 cells were induced to differentiate. Similarly to the observations in cell passaging, the amount of hDesR350P but not hDesWT or hDesE245D in cells was found to be reduced upon differentiation. Expression of a myosin heavy chain, a C2C12 differentiation marker, was higher in cells expressing either of the mutants than in untransfected or the cells transfected with the hDesWT desmin. Finally, the transfected cells were subjected to immuno-cytochemical analyses with respect to the coexpression of myosin heavy chain and of the various transfected desmins. Whereas hDesWT and hDesE245D were both present in approximately 70% of myosin heavy chain positive cells, about 10% of differentiating cells contained hDesR350P. Additional studies on C2C12 cells included the analyses of distribution of the A-type lamins in undifferentiated and differentiated cells. Whereas in the undifferentiated C2C12 cells some soluble A-type lamins could have been extracted, the differentiated cells appeared to contain very little of such lamins. Furthermore, the A-type lamin distribution in cells transfected with hDesR350P, but not hDesWT or hDesE245D, and subjected to differentiation was the same as in myoblasts, indicating the cells likely fail to undergo differentiation. These results demonstrate a very close connection between cytosolic and nuclear IFs. Finally, they indicate that the late onset of desminopathies could be correlated to the steady hDesR350P clearance from the cultured myoblasts leading to their failure of cells to differentiate.

Translation of abstract (German)

Mutationen in Genen, die für eines der vielen Intermediärfilament-(IF)-Proteine kodieren, sind die Ursache für eine Vielzahl humaner Erkrankungen. Mutationen im muskelspezifischen IF-Protein Desmin verursachen myofibrillärer Myopathien und in schweren Fällen auch Cardiomyopathien (Desminopathien). Sind nukleäre IF-Proteine wie die Lamine betroffen, so beobachtet man ein breites Spektrum von Erkrankungen, und zwar ebenfalls Muskeldystrophien und Cardiomyopathien aber auch systemische Erkrankungen wie die vorzeitigen Alterung oder Progerie. Die verschiedenen Desmin-Mutationen unterscheiden sich hinsichtlich der Schwere ihrer Auswirkungen auf die Fähigkeit des Proteins, geordnete Filamente zu bilden. Übereinstimmend mit dieser aus in vitro-Experimenten gewonnenen Erkenntnis beobachtet man auf Gewebeschnitten von Patienten das massive Auftreten von Desmin-Aggregaten sowie eine umfassende strukturelle Degeneration der Sarkomere. Die zugrunde liegenden Pathomechanismen sind weitestgehend nicht bekannt. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, die Auswirkungen einiger der signifikanten Desmin-Mutationen auf die Muskelzell-Differenzierung zu analysieren. Frühere Studien hatten gezeigt, dass Desmin-Aggregate und IFs nebeneinander in Myotuben auftreten können. Daher war es unser Ziel, zu ermitteln in welchem Umfang normales und mutiertes Desmin in Muskelzellen in gemeinsamen Strukturen auftauchen oder ob sie teilweise oder vollständig segregieren. Zu diesem Zweck haben wir die Maus-Zelllinie C2C12, die von Myoblasten abgeleitet ist und die sich in Kultur zu Myotuben differenzieren lässt, zur Analyse der Desmin-Mutanten eingesetzt. Um normales humanes Desmin (hDesWT) und von ihm abgeleitete Mutanten nach Transfektion in C2C12-Zellen von endogenem Desmin unterscheiden zu können, haben wir einen für humanes Desmin spezifischen Antikörper erzeugt. Als beispielhafte Mutanten haben wir hDesE245D und hDesR350P gewählt. Die erstere inkorporiert in das IF-System von Fibroblasten, die letztere segregiert vollständig und lagert sich in Form kleiner Aggregate ab. In C2C12-Zellen war das Ergebnis deutlich anders: während hDesE245D wie hDesWT nach Transfektion in endogene IFs inkorporiert wurde, war das Auftreten von hDesR350P in unterschiedlichen Zellen einer Kultur sehr variabel. Als wichtigstes Ergebnis aber erhielten wir, dass die Expression von hDesR350P im Verlauf nachfolgender Passagen fast vollständig verloren ging - ganz im Gegensatz zu der von hDesWT und hDesE245D, die relativ stabil exprimiert wurden. An diese Experimente anschließend wurden transfizierte C2C12-Zellen zur Differenzierung angeregt. Ähnlich zu den Beobachtungen während der fortgesetzten Kultur nicht differenzierender Zellen, wurde die Menge von hDesR350P, nicht aber die von hDesWT und von hDesE245D, in den Zellen während der Differenzierung stark reduziert. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Gegenwart von hDesR350P in den Zellen die Differenzierung behindert. Dagegen war die Expression der schweren Kette des Myosins (MHC), einem Differenzierungsmarker für C2C12-Zellen, höher in mit den Mutanten als in den mit hDesWT transfizierten Zellen. Weiterhin, während hDesWT und hDesE245D in etwa 70% der MHC-positiven Zellen gefunden wurde, enthielten weniger als 10% der differenzierenden Zellen hDesR350. Basierend auf diesen Beobachtungen mit C2C12-Zellen, könnte man vermuten, dass auch in Patienten bestimmte mutierte Desmin-Varianten die zelluläre Homöostase deutlicher stören als andere und daher zu einem früheren Beginn der Erkrankung führen. Schließlich deutet eine andere Beobachtung, die veränderte Menge an Lamin A im Nukleoplasma als Folge der Anwesenheit mutierter Desmine, auf einen weiteren Aspekt des Pathomechanismus hin, und zwar könnte die Expressionskontrolle einiger Gene durch Reduktion der Menge nukleoplasmatischen Lamins langfristig gestört werden und somit zur Entwicklung einer Desminopathie führen.