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Abstract

Signalkaskaden basieren auf fein abgestimmte Wechselwirkungen von Proteinen und sind Basis der Regulation aller biologischen Systeme. Das Hormon Erythropoetin (Epo) fördert die Bildung roter Blutkörpchen durch Bindung an den Erythropoetinrezeptor (EpoR). Dieser wird nur in geringen Mengen an der Oberfläche von Zellen des hämatopoetischen Systems präsentiert, zeigt aber eine anpassungsfähige Reaktion auf Aktivierung durch Epo. Die Sensitivität einer Signalweiterleitung ist von der Menge an Rezeptoren an der Plasmamembran abhängig. Der EpoR zeigt auch ligandenunabhängig eine ständige Zirkulation von Rezeptoren aus dem intrazellulärem Pool an die Membran und zurück. Das System bleibt dadurch adaptiv. Alle Vorgänge sind mit dem Aufbau und der Kompartimentierung der Membran, sowie den Transportvorgängen in der Zelle verknüpft. Fluoreszenzbasierende Methoden der Mikroskopie bieten vielfältige Möglichkeiten die räumliche und zeitliche Bewegung von Rezeptoren in Zellen zu untersuchen. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung molekularer Prozesse, die beim Epo-induzierten Signalweg eine wichtige Rolle spielen. Dazu wurde einerseits die Mobilität des Rezeptors und andererseits seine Internalisierung mit Einzelmolekülmethoden untersucht. Der EpoR konnte zu diesem Zweck stöchiometrisch markiert und seine Dynamik und molekulare Interaktion in der Zellmembran auf Einzelmolkülniveau durch Einzelpartikelverfolgung beobachtet werden. Die Studien der Mobilität des EpoR in der Zellmembran konnten demonstrieren, dass aktivierte Rezeptoren eine erhöhte Neigung zur Oligomerisierung aufweisen. Die mittlere Bewegung der Rezeptorpartikel an der Membran bleibt weitestgehend unbeeinflusst vom Ligandenstimulus, doch erhöht sich der Anteil gerichteter Bewegung der Rezeptoren. Es konnte gezeigt werden, dass bevorzugt Zusammenlagerungen von Rezeptoren an der Membran nach Aktivierung internalisiert werden. Der interhelikale Abstand von Rezeptorhomodimeren ist ausschlaggebend für die fehlerfreie Translokation und den Rücktransport internalisierter Rezeptoren an die Membran. Der inaktive EpoR scheint mit lipid rafts assoziiert zu sein. Auf einer weiteren Beobachtungsebene konnte die Kinetik des Signaltransduktionsweges und die Heterogenität der zugrundeliegenden Prozesse basierend auf zeitaufgelösten Einzelzellmessungen betrachtet werden. Dabei wurde der Rezeptortransport durch eine neue Methode analysiert, die die sich heterogen verhaltene Zellen durch ein zelluläres Ensemble-Modell beschreibt. Eine umfassende Modellanalyse identifizierte Recycling-, Internalisierungs- und Synthesekinetik als Ursprung zellulärer Variabilität in der Dynamik des EpoRs. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse konnten aufgrund der Verwendung einzelmolekülsensitiver Methoden mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung, erstmals zu einer genaueren Charakterisierung der Dynamik des EpoR auf Einzelmolekülebene verhelfen.