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Abstract

The adult mammalian brain contains neural stem cells (NSCs) that continue to generate neurons throughout adulthood, a process referred to as neurogenesis. Adult NSCs are relatively quiescent and undergo cell division only when they are activated to reenter the cell cycle. Two types of quiescent NSCs have been previously identified, which can be distinguished on the basis of differential expression of Prominin-1 (Pro). Upon activation and asymmetrical division, a NSC self-renews and gives rise to a transit-amplifying precursor (TAP), which will rapidly divide while differentiating into neuroblasts. Our group has developed an approach based on fluorescence activated cell sorting (FACS) to purify quiescent NSCs (qNSCs), activated NSCs (aNSCs) and TAPs. We have previously shown that in adult NSCs the orphan nuclear receptor Tailless (Tlx, NR2E1) is essential for promoting cell cycle entry and the transition from qNSCs to aNSCs. Therefore, mice lacking Tlx expression (Tlx-/-) represent a nice model system to investigate the mechanisms underlying NSC activation. To further understand the molecular mechanisms underlying the effect of TLX on NSC activation I have compared gene expression in NSCs isolated from wild type (WT) and Tlx-/- mice. This analysis revealed an upregulation of Hes1 expression and a significant change in the expression of several genes associated to the Notch pathway in both Pro+ and Pro- mutant qNSCs. Moreover, in the absence of TLX, the nuclear localization of the Notch intracellular domain (NICD) was increased in Pro- qNSCs, suggesting hyper activation of the canonical Notch pathway, which may prevent cell cycle entry. To provide support for this hypothesis, I have investigated the effect of pharmacological inhibition of Notch signaling on NSC activation. These experiments revealed that indeed blockade of Notch signaling increased proliferation of both WT and Tlx-/- precursors. They also showed that inhibition of Notch signaling leads to the generation of Pro+ qNSCs from the Procell pool, suggesting a lineage relationship between the two groups of qNSCs. Since TLX is a transcriptional repressor, it may modulate Notch signaling by repressing the expression of Hes1. To further investigate this hypothesis I have taken advantage of luciferase and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays and I was able to show that TLX represses Hes1 expression and that this effect requires the presence of the RBPJ binding site. Taken together, my results have uncovered a previously unknown function of TLX in the regulation of Hes1 expression, which affects the activation of the canonical Notch pathway in NSCs and also the progression from Pro- to Pro+ qNSCs.

Translation of abstract (German)

Das adulte Säugetiergehirn enthält neurale Stammzellen (NSCs), die lebenslang Nervenzellen bilden, ein Prozess, den man als Neurogenese bezeichnet. Die adulten NSCs befinden sich meist im ruhenden Zustand und teilen sich nur nach Aktivierung, um erneut in den Zellteilungszyklus zu treten. Kürzlich wurden zwei Typen von ruhenden NSCs identifiziert, die man aufgrund der unterschiedlichen Prominin-1 (Pro) Expression unterscheiden kann. Nach Aktivierung und asymmetrischer Zellteilung erneuert sich die NSC selbst, und es entsteht jeweils eine NSC und eine Transit-Amplifying-Precursorzelle (TAP), die sich schnell weiterteilt und in Neuroblasten differenziert. Unsere Arbeitsgruppe hat eine Methode entwickelt, die auf der Fluoreszenz aktivierten Zellsortierung (FACS) beruht, um ruhende NSCs (rNSCs), aktivierte NSCs (aNSCs) und TAPs aufzureinigen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass in adulten NSCs der Orphan-Nukleare-Rezeptor Tailless (TLX, NR2E1) essentiell ist für die Einleitung des Zellzyklus und den Übergang von rNSCs zu aNSCs. Die Tlx knockout (Tlx-/-) Maus stellt deshalb ein interessantes Model zur Untersuchung von Mechanismen der NSCs Aktivierung dar. Um zu verstehen, welche molekularen Mechanismen dem Effekt von TLX bei der NSC Aktivierung zugrunde liegen, habe ich die Genexpression isolierter NSCs in Wildtyp (WT) und Tlx-/- Mäusen verglichen. Diese Analysen haben eine Hochregulierung der Hes1 Expression und eine signifikante Expressionsänderung verschiedener mit dem Notch Signalweg assoziierter Gene, sowohl in Pro+ als auch in Pro- mutierten rNSCs nachgewiesen. Darüberhinaus war bei Abwesenheit von TLX die Kernlokalisierung der Notch intrazellulären Domäne (NICD) in Pro- rNSCs erhöht. Dies deutet auf eine Hyperaktivierung des kanonischen Notch Signalweges hin, die den Eintritt in den Zellzyklus verhindert. Um diese Hypothese zu überprüfen, habe ich den Effekt der pharmakologischen Blockierung von Notch auf die NSC Aktivierung untersucht. Durch die Blockierung des Notch Signalweges zeigten die Experimente tatsächlich eine Proliferationszunahme sowohl in WT als auch in Tlx-/- Vorläuferzellen. Ich konnte ebenfalls zeigen, dass durch die Inhibierung von Notch Pro+ rNSCs aus dem Pro-Zellpool entstehen, was auf eine “lineage relationship” schließen lässt. Da TLX als Transkriptionsrepressor fungiert, kann es durch Herunterregulierung der Hes1 Expression Notch Signaling beeinflussen. Zur weiteren Untersuchung dieser Fragestellung habe ich Luziferase und Chromatin-Immunopräzipitations (ChIP) Assays eingesetzt und konnte nachweisen, dass TLX die Expression von Hes1 unterdrückt, wobei eine RBPJ Bindungsstelle notwendig ist. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse eine bisher unbekannte Funktion von TLX bei der Regulation der Hes1 Expression, welche die Aktivierung des kanonischen Notch Signalweges in NSCs und den Übergang von Pro- zu Pro+ rNSCs beeinflusst.