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Abstract

The essential, vertebrate-specific RanBP2/RanGAP1*SUMO1/Ubc9 complex is a fascinating macromolecular machine positioned at the nuclear pore complex during interphase. It is a unique composite SUMO E3 ligase and serves as a docking site for nuclear transport complexes. Moreover, the RanBP2 complex can stimulates Ran-GTP hydrolysis via its four Ran binding domains and the associated RanGAP activity. In the first part of this work, I wanted to obtain insight into the molecular mechanism of this composite E3 ligase. In order to unravel how it interacts with and activates its cognate E2 conjugating enzyme, I created a stable Ubc9∼SUMO thioester mimic that allowed in vitro interaction studies. I found evidence that SUMOylation via the RanBP2 complex depends on the formation of the catalytically productive, folded-back thioester conformation, similarly to ubiquitination. In collaboration with the group of Teresa Carlomagno (EMBL, Heidelberg), we mapped the interaction surfaces of the thioester mimic on the RanBP2 complex via NMR. Our analyses suggest that thioester-binding is not only achieved by the suspected interaction with RanBP2 itself, but also by a backside interaction between the SUMO1 molecule in the complex and the thioester-Ubc9. For this interaction, the complex opens up at its Ubc9/SUMO1-interface suggesting that it is not a static, but structurally dynamic entity during catalysis. In the second part of this work, I investigated possible roles of the RanBP2 complex for nuclear transport complexes, using a reconstituted version that contained RanGAP1, the SUMO E3 ligase region, two FG-repeat clusters and two Ran binding domains. I could show that the RanBP2 complex specifically binds and disassembles export complexes formed with the prototypic export receptor Crm1. The two FG-repeat clusters mediate RanBP2’s tight association with Crm1, which is followed by Ran binding domain-dependent cargo release and Ran-GTP hydrolysis. As the Crm1/RanBP2 interaction is compatible with RanBP2’s SUMO E3 ligase activity, my work also allows speculating about a possible Crm1-dependent substrate recruitment mechanism for the RanBP2 E3 ligase complex.

Translation of abstract (German)

Der RanBP2/RanGAP1*SUMO1/Ubc9 Komplex ist eine faszinierende makromolekulare Maschine an der Kernpore, welche essentiell und spezifisch für Vertebraten ist. Er stellt sowohl eine einzigartige, zusammengesetzte SUMO E3 Ligase dar als auch eine Bindestelle für Kerntransport Rezeptoren. Darüber hinaus ist der Kom- plex in der Lage, Ran-GTP Hydrolyse mit seinen vier Ran-Bindedomämen und der assoziierten RanGAP Aktivität zu stimulieren. Im ersten Teil dieser Arbeit versuche ich Einblicke in the katalytischen Mechanis- mus der zusammengesetzten E3 Ligase zu erlangen. Vor allem hat mich diesbezüglich interessiert, wie der Komplex mit dem E2 konjugierenden Enzym Ubc9 interagiert und es aktiviert. Um die dazu nötigen in vitro Interaktionsstudien druchführen zu können, habe ich zunächst einen stabilen Ubc9∼SUMO Thioester Mimik hergestellt. Mit diesem konnte ich Hinweise darauf finden, dass, ähnlich der Ubiquitinie- rung, SUMOylierung durch den RanBP2 Komplex von der Bildung einer katalytisch produktiven, sog. zurück-gefalteten Konfomration Thioesters abhängig ist. In Kol- laboration mit der Gruppe von Teresa Carlomagno (EMBL, Heidelberg), konnten wir die Interaktionsoberfläche des Thioester Mimiks auf dem RanBP2 Komplex über NMR bestimmen. Unsere Analyse wies darauf hin, dass die Thioester-Bindung nicht nur über die vermutete Interktion mit RanBP2 selbst vermittelt wird, sondern auch über eine Rückseiten-Interaktion zwischen dem SUMO1 Molekül im Komplex und dem Thioester-Ubc9. Für diese zusätzliche Interaktion öffnet sich der Komplex an seiner Ubc9/SUMO1 Kontaktfläche, was zeigt, dass er nicht statisch, sondern eine strukturell dynamische Einheit während der Katalyse ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit habe ich eine mögliche Rolle des RanBP2 Kom- plexes im Kerntransport untersucht. Dazu habe ich eine rekonstituierte Version des Komplexes verwendet, die sowohl RanGAP1 als auch die SUMO E3 Ligase Region, zwei FG-Repeat Cluster und zwei Ran-Bindedomänen beinhaltet. So konnte ich zeigen, dass der RanBP2 Komplex spezifisch Exportkomplexe mit dem prototypischen Export Rezeptor Crm1 binden und zerlegen kann. Die zwei FG-Repeat Cluster ver- mitteln dabei die enge Bindung zwischen RanBP2 und Crm1. In nachgeschalteten Schritten kann dann das Exprotkomplex-Substrat durch die Ran-Bindedomänen dissoziieren und Ran-GTP Hydrolyse erfolgen. Da die Crm1/RanBP2 Interaktion mit der SUMO E3 Ligase Aktivität von RanBP2 kompatible ist, erlaubt meine Arbeit Spekualtionen über einen Crm1-vermittelten Substrat-Rekrutierungsmechanismus für den RanBP2 E3 Ligase Komplex.