German Title: Identifizierung und Charakterisierung von Genen welche durch DNA Methylierung in der chronisch lymphatischen Leukämie dereguliert sind

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Abstract

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is one of the most common leukemias in adults in the Western world characterized by the accumulation of mature-appearing B-cells in the peripheral blood, lymphoid tissues and bone marrow. The use of novel inhibitors targeting BCR- and PI3K-signaling in CLL as well as the application of CD20-antibodies in the clinic have led to improved outcome for the patients. Nevertheless, CLL remains an incurable disease and in order to develop new treatment strategies, there is still a strong need to elucidate the pathomechanism of CLL further. CLL is amongst other aspects a disease of the epigenome, displaying genome-wide hypomethylation while specific regions are hypermethylated, resulting in the deregulation of tumor suppressors, non-coding RNAs and oncogenes. Interestingly, DNA methylation in CLL patients was shown to be relatively stable over time suggesting that genes which are deregulated by this DNA modification are affected permanently, independent of disease stage and course. In this project, it was therefore aimed to identify and characterize genes deregulated in CLL by DNA methylation, which are likely involved in the pathomechanism of the disease. To this end, expression and methylation array profiling was conducted in CD19+ sorted CLL cells and B-cells of healthy donors. Out of the 1,866 genes identified as differentially expressed between cancer cells and their non-malignant counterpart, 33 showed significantly differentially methylated regions (DMR) that displayed negative correlation with gene expression. Technical validation using mass spectrometry based quantification of methylation confirmed the presence of DMRs in 17 of these genes including the transcription and stem cell factor KLF4. KLF4, of which repression and hypermethylation could be confirmed in a larger patient subset, was previously shown to play an important role in B-cell differentiation and maturation and further to act as tumor suppressor in other B-cell malignancies including classical- and non-Hodgkin lymphoma. Moreover, KLF4 was shown to be a downstream target of NOTCH1 which is recurrently mutated and constitutively active in CLL. In fact, treatment of six different lymphoblastoid and leukemia cell lines and of primary peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from eight CLL patients with γ-secretase inhibitor resulted in the inhibition of NOTCH1 activity and in the re-expression of KLF4 on RNA and protein level, suggesting transcriptional regulation of KLF4 by NOTCH1. Furthermore, expression of KLF4 was correlated with levels of BCL-2 family members BAK, BAX and BCL-2 as well as the cell cycle regulator CCND1 in primary CLL and B-cells. Although, overexpression of KLF4 in three leukemia cell lines did not induce apoptosis in these cells, it resulted in the deregulation of a number of genes involved in prominent signaling pathways which are highly relevant for the pathogenesis of CLL, including BCR- and PI3K-signaling. In summary, these findings suggest the repression of KLF4 by DNA promoter methylation and NOTCH signaling in CLL. Overexpression of KLF4 results in the deregulation of genes involved in signaling pathways important for B-cells which indicates that KLF4 is in part involved in keeping the CLL cells in a highly activated state.

Translation of abstract (German)

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) ist eine der am häufigsten auftretenden Leukämieformen bei Erwachsenen in der westlichen Welt. Die Anreicherung von scheinbar ausgereiften B-Zellen im peripheren Blut, den lymphatischen Organen und dem Knochenmark ist charakteristisch für diese Krankheit. Obwohl die Applikation von neu entwickelten Medikamenten in den letzten Jahren zu einer Verbesserung des Krankheitsverlaufs der Patienten geführt hat, ist die CLL nach wie vor unheilbar. Daher ist die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien von großer Bedeutung. Die CLL ist unter anderem eine Krankheit des Epigenoms, definiert durch genomweite Hypomethylierung und parallel auftretender Hypermethylierung in spezifischen Regionen. Hieraus resultiert die Deregulation von Tumorsuppressoren, nicht-kodierenden RNAs und Onkogenen. Die DNA Methylierung bleibt interessanterweise in der CLL über lange Zeit stabil. Gene die durch diese DNA Modifikation dereguliert werden könnten daher permanent beeinflusst sein, unabhängig vom Status und Verlauf der Krankheit. Das Ziel dieses Projektes war es, Gene zu identifizieren und zu charakterisieren, die in der CLL durch DNA Methylierung dereguliert sind und somit eine Rolle im Pathomechanismus der Krankheit spielen könnten. Zu diesem Zweck wurden mit Hilfe von Arrays Expressions- und Methylierungnsanalysen von CD19+ CLL Zellen und B-Zellen gesunder Spender durchgeführt. Es konnte eine unterschiedliche Expression zwischen den Krebszellen und den normalen B-Zellen von 1866 Genen gezeigt werden. Von diesen wiesen 33 signifikant differentiell methylierte Regionen (DMR) auf, welche eine negative Korrelation zur Genexpression zeigten. Durch Quantifizierung der DNA Methylierung mit Hilfe von Massenspektrometrie konnten 17 dieser Gene validiert werden. Unter diesen befand sich auch der Stammzell- und Transkriptionsfaktor KLF4. Frühere Studien zeigen, dass KLF4 eine wichtige Rolle in der Differenzierung und Reifung von B-Zellen spielt und in anderen B-Zell Krankheiten als Tumorsuppressor agiert. Des Weiteren ist KLF4 ein Ziel-Gen von NOTCH1, welches in der CLL mutiert und konstitutiv aktiv ist. Tatsächlich, zeigte die Behandlung mit γ-sekretase Inhibitor von sechs verschiedenen lymphoblastoiden und leukämischen Zelllinien, sowie von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von 8 CLL Patienten, nicht nur eine Inhibition der NOTCH1 Aktivität in diesen Zellen, sondern auch eine Re-Expression von KLF4 sowohl auf RNA als auch auf Protein Ebene. Es kann somit eine transkriptionelle Regulation von KLF4 durch NOTCH1 angenommen werden. Überdies korrelierte die Expression von KLF4 in primären CLL- und B-Zellen mit den Mitgliedern der BCL-2 Proteinfamilie BAK, BAX und BCL-2, sowie mit dem Zellzyklus Regulator CCND1. Die transiente Überexpression von KLF4 in drei Leukämie Zelllinien führte zu einer Deregulation von Genen welche an BCR- und PI3K-Signaltransduktion beteiligt sind. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Repression von KLF4 durch DNA Methylierung und NOTCH Signaltransduktion dazu beiträgt die CLL Zellen in einem hoch aktivierten Zustand zu halten, welcher die Expansion und das Überleben der malignen Zellen unterstützt