German Title: Dinukleare Kupfer(II) Patellamid-Komplexe: Hydrolaseaktivität und in vivo Stabilität

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Abstract

The blue-green alga Prochloron produces and exports cyclic octapeptides (patellamides) to its obligate host, the ascidian Lissoclinum patella, in large quantities. Since the CuII concentration in the ascidians is a factor of 104 greater when compared to the surrounding sea water, previous studies on model CuII complexes with synthetic cyclic octapeptide derivatives were performed and revealed these complexes to be efficient phosphatase- and carboanhydrase-mimics. Their biological role, however, is so far unknown. With the work presented in this thesis, the dependence of the phosphatase activity of dinuclear patellamide complexes on the side chain configuration as well as on the catalytic metal centre is explored. The results show that the complexes based on ligands with the natural R and S configuration of the patellamide-ligand backbone exhibit 3-5 times higher hydrolysis efficiencies as compared to complexes with ligands that exhibit 4S side chain configuration. Beyond that, the effect on phosphatase efficiency induced by the substitution of the catalytic metal centre CuII for ZnII was investigated. Since only one of the three ZnII patellamide complexes showed catalytic activity, a structural investigation was carried out. In addition to hydrolysis measurements this was accomplished by means of NMR, MS, ITC and a combined MM and QM study. The results indicate a similar binding behaviour of patellamides towards ZnII as shown for CuII, i.e. a coordination site spanned by two nitrogen atoms that are part of a heterocycle and a deprotonated amide nitrogen. Therefore, the lack of phosphatase activity might be caused by the small stability of these complexes under aqueous conditions, as used for the hydrolysis assay. In addition, α- and β-glycosidase- as well as β-lactamase-like activity of the CuII patellamide complexes was examined. It was shown that the imidazole-based complexes act as hydrolases not only for phosphate ester cleavage at pH 7-8 but also for the hydrolysis of glycosidic bonds at alkaline conditions (pH 10). Moreover, β-lactamase-like activity was observed at pH 11.5 for one of the patellamide based complexes. Consequently, these results indicate the ability of the CuII complexes to act as very efficient, pH-dependent catalysts. Recent findings from BEHRENDT et al. pointed to a rapid fluctuation of the pH in close proximity to Prochloron depending on the irradiance. Therefore, the glycosidase and lactamase results could indicate the dinuclear CuII complexes to adopt different functions during day- and night-time, respectively. Abstract X As a contribution towards the elucidation of the metabolic significance of the patellamide complexes, the formation of the complexes was investigated in vitro in buffer at pH 8.2 as well as in vivo. Therefore, a patellamide ligands with an appended reporter groups (RG) were prepared (see Figure 1). The fluorescent tag Atto550 as well as the spin label Proxyl were chosen as the reporter groups. In vitro studies with H4pat-Atto550 indicate the formation of a CuII complex in buffer, however, results from EPR studies with the ligand H4pat-Proxyl and CuII could so far not verify this finding. In addition, a protocol for the uptake of patellamides by Prochloron was developed allowing the introduction of the ligand H4pat-RG into the cells. Results from flow cytometry as well as confocal microscopy support the formation of a CuII patellamide complex in vivo. In addition, preliminary in vivo hydrolysis measurements are presented. In conclusion, the work presented contributes to an improved understanding of the hydrolase-like activities of the patellamide-based copper(II) complexes and gives a first insight on the stabilities of the complexes in Prochloron cells.

Translation of abstract (German)

Die Blau-Grün Alge Prochloron produziert und exportiert in großen Mengen zyklische Oktapeptide (Patellamide) an ihren obligaten Wirt, Lissoclinum patella (Ascidie). Da die Kupfer(II)-Ionenkonzentration in den Ascidien im Vergleich zum umgebenden Meerwasser um den Faktor 104 erhöht ist, wurden Studien über vermeintliche Kupfer(II)-patellamid Komplexe durchgeführt. Mit Hilfe dieser Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass es sich bei den dinuklearen Kupfer(II)-Komplexen der Peptide um effiziente Katalysatoren für biologisch relevante Hydrolysereaktionen handelt, wie z.B. Phosphatase und Carboanhydrase. Ihre Rolle im Stoffwechsel der Ascidien und der Blau-Grün Algen ist jedoch bisher noch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden Studien zur Abhängigkeit der Phosphataseaktivität der dinuklearen Kupfer(II)-Komplexe von der Seitenkettenkonfiguration der Liganden sowie vom katalytischen Metallzentrum durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Komplexe mit Liganden natürlicher RS Stereokonfiguration drei- bis fünffach erhöhte Hydrolyseeffizienz aufweisen im Vergleich zu Komplexen mit Liganden nicht-natürlicher Stereokonfiguration. Darüber hinaus wurde der Einfluss des Metallzentrums auf die Phosphataseeffizienz der Komplexe durch den Austausch von Kupfer(II) durch Zink(II) untersucht. Da nur einer der drei untersuchten Zink(II)-patellamid Komplexe katalytische Aktivität zeigte, wurde eine strukturelle Untersuchung der Komplexe durchgeführt. Dazu wurden neben den Hydrolysemessungen auch NMR-, MS- und ITC-Titrationen, sowie eine vergleichende MM- und QM-Studie unternommen. Die Ergebnisse der Untersuchung deuten auf ein ähnliches Bindungsverhalten von Zink(II) in Patellamiden wie bereits für Kupfer(II) gezeigt. Dabei bindet das Metallion in einer Bindungstasche, die von zwei Stickstoffen in einem Heterozyklus und einem deprotonierten Amidstickstoff aufgespannt wird. Die ausbleibende Phosphataseaktivität ist daher vermutlich auf eine mangelnde Stabilität der Zink(II)-Komplexe unter wässrigen Bedingungen zurückzuführen. Darüber hinaus wurden die α- und β-Glykosidase- sowie β-Lactamase-artige Aktivität der Kupfer(II)-patellamid Komplexe untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Imidazol-basierten Komplexe nicht nur Phosphatester bei pH 7-8 spalten können, sondern auch dazu in der Lage sind unter basischen Bedingungen (pH 10) glykosidische Bindungen zu hydrolysieren. Außerdem konnte β-Lactamase-artige Aktivität bei pH 11.5 für einen der Patellamid-basierten Komplexe beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kupfer(II)-Komplexe pH-abhängige, schaltbare Kurzfassung XII Katalysatoren sind. BEHRENDT et al. berichteten kürzlich, dass der pH Wert in unmittelbarer Nähe zu Prochloron in Abhängigkeit der Beleuchtungsstärke fluktuiert. Vor dem Hintergrund dieser Ergebnisse könnten die Hydrolyseergebnisse bedeuten, dass die dinuklearen Kupfer(II)-Komplexe verschiedene Funktionen im Laufe des Tages, in Abhängigkeit der Sonneneinstrahlung, erfüllen. Um einen Beitrag zur Aufklärung der metabolischen Bedeutung der Patellamid-Komplexe zu leisten, wurde die Bildung der Kupfer(II)-Komplexe in vitro (pH 8.2) sowie in vivo untersucht. Dazu wurden Patellamid-Liganden mit verschiedenen Reportergruppen dargestellt (siehe Abbildung 1). Als Reportergruppen wurden zum einen der Fluoreszenzfarbstoff Atto550 gewählt, sowie zum anderen das Spin-Label Proxyl. In vitro Untersuchungen mit dem Liganden H4pat-Atto550 weisen auf die Bildung eines Kupfer(II)-Komplexes in gepufferter Lösung hin, allerdings konnten ESR-Experimente mit dem Liganden H4pat-Proxyl dieses Resultat bisher nicht eindeutig verifizieren. Im nächsten Schritt wurde ein Protokoll für die Aufnahme der Modell-Liganden in die Zellen etabliert. Die Ergebnisse von Durchflusszytometrie und Konfokalmikroskopie deuten auf die Bildung eines Kupfer(II)-patellamid Komplexes in vivo hin. Abschließend werden erste in vivo Hydrolysemessungen präsentiert. Folglich trägt die hier vorgelegte Arbeit zu einem besseren Verständnis der Hydrolase-artigen Aktivität der Patellamid-basierten Kupfer(II)-Komplexe bei und gibt einen ersten Einblick in die Stabilität der Komplexe in Prochloron Zellen.