Preview

PDF, German Download (7MB) | Terms of use

Abstract

Die Fluoreszenzmikroskopie hat sich als leistungsstarke Technik in allen Bereichen der Naturwissenschaften zur Untersuchung von Strukturen und dynamischen Prozessen etabliert. Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurden Techniken entwickelt, deren Möglichkeiten weit über die herkömmlicher Mikroskopie hinaus reichen und nicht nur das Beobachten kleinster Objekte erlauben, sondern selbst die beugungsbedingte Auflösungsgrenze optischer Systeme überwinden. Mikroskopie im Allgemeinen und hochauflösende Methoden im Speziellen sind jedoch nur so gut wie die eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe. Während modernste Technik in der Lage ist, dreidimensionale Aufnahmen kleinster Strukturen bis hin zu einzelnen Emittern abzubilden, richtet sich nun der Fokus auf die Entwicklung neuer, leistungsfähiger Fluoreszenzsonden, deren Fähigkeit sich nicht alleine auf das Emittieren von Fluoreszenz beschränkt. Durch geschicktes Design können nicht nur elementare Eigenschaften wie molekulare Helligkeit und Photostabilität optimiert werden. Vielmehr kann eine maßgeschneiderte Funktionalisierung völlig neue Anwendungsmöglichkeiten eröffnen. In dieser Arbeit wurden neue Fluoreszenzsonden auf Basis einer unnatürlichen Aminosäure entwickelt, charakterisiert und in unterschiedlichen Methoden eingesetzt. Der modulare Aufbau ermöglicht das einfache Kombinieren unterschiedlicher Fluorophore mit einem Bipyridin-Liganden zu kompakten Fluoreszenzsonden, die aufgrund der Komplexierung von Metallionen zwischen einem hellen, stark fluoreszierenden und einem dunklen Zustand geschaltet werden können und daher den Einsatz lichtgetriebener Prozesse überflüssig machen. Eine Vielzahl an Farbstoffkonjugaten konnte erfolgreich dargestellt werden, die sowohl in Ensemble- als auch in Einzelmolekülmessungen untersucht und anschließend zur Markierung geeigneter Zielstrukturen in fixierten Zellen eingesetzt wurden. Die überzeugendsten Ergebnisse wurden mit dem Atto633-Derivat erzielt, das eine Restfluoreszenz von etwa 11 % zeigt sowie eine Komplexbildungskonstante für Cu(II) von (8.11 ± 0.24) 106 M-1, die aus der Schaltkinetik einzelner Emitter bestimmt wurde. Das Potential der chemischen Schalter wurde durch die Anwendung in der Lokalisationsmikroskopie demonstriert, aus der Halbwertsbreiten der markierten Filamente bestimmt wurden, die mit etwa 70 nm deutlich unterhalb der optischen Auflösungsgrenze liegen. Die Vielseitigkeit wurde durch den Einsatz im chemischen Multiplexing gezeigt, das zudem noch mit der STED-Mikroskopie kombiniert wurde, um hochaufgelöste, mehrfarbige Bilder aus einem einzigen spektralen Kanal zu erzeugen.